基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術的喬林與葉林杜仲葉次生代謝產物比較研究

申夢園，吳 蓓，段涵琪，楊放晴，王 福，陳鴻平，劉友平

1西南特色中藥資源國家重點實驗室；2成都中醫藥大學藥學院，成都 611130

杜仲葉為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv的干燥葉，于2005版《中華人民共和國藥典》中首次收載入藥，具有補肝腎，強筋骨的功效[1]。主要成分為苯丙素類、黃酮類、環烯醚萜類及有機酸類等[2]。杜仲傳統藥用部位為皮，由于環剝技術的不規范使得大量的杜仲皮遭到嚴重破壞，難以再生。杜仲葉有較強的再生能力，產量巨大，目前有關杜仲葉成分的研究多有報道[3]。

杜仲根據栽培方式不同分為喬林和葉林杜仲，喬林杜仲是高25 m以上的傳統杜仲樹，以經營木材為目的，生長周期長，采葉困難[4]，導致杜仲葉投入與產出效率相對較低，為此人們在科學技術水平上進行創新，將喬林杜仲進行矮化密植形成葉林杜仲，使產葉量增大，經營周期縮短，采葉方便[5]。目前葉林杜仲已在湖北勛西、河南汝陽、靈寶，陜西略陽等地大規模人工栽培[6]。我國藥典尚未對杜仲葉的栽培方式提出明確要求，對于喬林與葉林杜仲葉的植物代謝組是否有差異，已有文獻對喬林與葉林杜仲葉中綠原酸、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷及總黃酮進行了研究，發現不同產地、不同采收時間杜仲葉中總黃酮、綠原酸、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷含量變化不一[7,8]，這些研究為喬林杜仲葉與葉林杜仲葉化學成分的深入奠定了基礎，但研究指認的成分較少，難以全面有效闡明杜仲葉成分譜的變化。

本實驗將在前人研究的基礎上以四川省旺蒼縣和通江縣兩個產地的3年生喬林杜仲葉和新引種的葉林杜仲葉為研究對象，通過超高效液相-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜技術對喬林與葉林杜仲葉進行無差別代謝全成分分析。并結合化學模式識別技術對兩種栽培方式的杜仲葉進行比較研究，以期為杜仲葉用模式合理栽培和利用提供理論基礎。

1 材料與方法

Vanquish型超高效液相色譜聯用Q-Exactive型四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；L-100型高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)；UPTUO-I-1000TE超純水制備儀(成都超純科技有限公司)；BT125D型十萬分之一電子天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；Ultrasonic Cleaner型超聲機(功率100 W，50 Hz)。

綠原酸(批號：CHB190121)；蘆丁(批號：CHB190110)；京尼平苷酸(批號：CHB201202)；咖啡酸(批號：CHB180308)；兒茶素(批號：CHB180809)；二氫槲皮素(批號：CHB190105)；阿魏酸(批號：wkq21010504)；車葉草苷(批號：CHB180522)；阿魏酸對照品購自四川省維克奇生物科技有限公司；其余均購自成都克羅馬生物科技有限公司；純度均≥98%。乙腈(美國Fisher Chemical，色譜純)；甲醇(北京化工廠，分析純)；實驗用水為超純水。

杜仲葉藥材采自四川省廣元市旺蒼縣深溪村杜仲試點種植基地和四川省巴中市通江縣石婆山杜仲規模化種植基地，經成都中醫藥大學嚴鑄云教授鑒定為杜仲科植物杜仲E.ulmoidesOliv的干燥葉，于實驗室藥材儲藏室保存。每個產地定點采集五棵喬林樹杜仲葉和五棵葉林樹杜仲葉，為了盡可能消除杜仲樹個體間的差異，同一產地同種栽培方式的杜仲葉粉末取等量混合均勻，平均分成三份。樣品信息如表1所示。

表1 杜仲葉樣品收集信息

1.1 溶液配制

1.1.1 供試品溶液

精密稱取混合均勻的杜仲葉粉末約1 g(過3號藥典篩)，置于具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇20 mL，超聲處理1.5 h(500 W，40 kHz)后，放涼，補足失重，濾過，離心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)，取濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.1.2 對照品溶液

分別取綠原酸、蘆丁、京尼平苷酸、兒茶素、二氫槲皮素、阿魏酸、車葉草苷、咖啡酸對照品適量，分別置1 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，所得對照品溶液濃度分別為1.09、0.57、1.18、0.72、0.38、0.49、0.66、1.24 mg/mL，置于4 ℃的冰箱中冷藏保存。

1.2 檢測條件

1.2.1 色譜條件

Vanquish型超高效液相色譜聯用Q-Exactive 型四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀，Agilent Extend-C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)，流動相 0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0～15 min，7%→18% B；15～35 min，18%→25% B；35～45 min，25%→35% B；45～50 min，35%→45% B)，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量3 μL。檢測波長254 nm。

1.2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正、負離子切換模式掃描，掃描范圍100～1 500m/z，Full MS一級分辨率35 000，二級分辨率17 500；正負離子同時掃描，噴霧電壓為3.5 kV；離子源溫度350 ℃，鞘氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb，離子傳輸管溫度320 ℃。S 狀透鏡電壓(S-Lens)50 V，碰撞能量梯度為20、40、60 eV。

1.2.3 數據處理

利用Compound Discoverer 3.0軟件將UPLC-Q-Orbitrap HRMS所采集的原始數據提取擬合出分子式和一級質譜的精確相對分子質量，將所得結果與mzCloud，mz Vault，ChemSpider數據庫及本地中藥成分高分辨質譜數據庫OTCML 進行匹配，對匹配結果設置過濾參數：峰面積閾值8萬，一級準分子離子及二級碎片離子質量偏差5 ppm(1 ppm=1×10-6)，匹配度分值>80。將過濾后的目標化合物的碎片離子信息與對照品及相關參考文獻信息進行比對，對化合物鑒定。

2 結果與分析

杜仲葉UPLC-Q-Orbitrap HRMS的總離子流圖(total ion chromatograms，TIC)如圖1和圖2所示。喬林與葉林杜仲葉的化學成分在物質種類上較為一致如圖3所示。其中共有成分有62種，黃酮類9種，苯丙素類9種，環烯醚萜類2種，有機酸類21種，香豆素類5種，其他類16種，結果見表2。其中8種成分與對照品比對而確認，其余化合物結合數據庫及參考文獻鑒定。

圖1 在UPLC-Q-Orbitrap HRMS負離子模式下通江縣喬林杜仲葉的總離子流圖

圖2 在UPLC-Q-Orbitrap HRMS正離子模式下通江縣喬林杜仲葉的總離子流圖

圖3 負離子模式下通江縣喬林與葉林杜仲葉層疊圖

表2 杜仲葉化學成分的質譜信息

3.1 黃酮類化合物裂解途徑

黃酮類化合物是一類含有2-苯基色原酮結構的化合物，主要包括黃酮苷元和黃酮苷類。在負離子模式下，黃酮苷類化合物首先易脫去糖基，而后進行黃酮苷元的裂解，黃酮苷元類裂解方式主要有兩種：一是脫去CO、CO2、H2O、C2H2O等中性離子；二是發生狄爾斯-阿爾德(RDA)裂解，C環裂開產生具有特征性的二級碎片，此裂解方式也是黃酮類化合物的主要裂解規律。本研究共鑒定和推測出9種黃酮類化合物。以化合物51號為例，在負離子模式下的準分子離子峰為m/z609.146 7[M-H]-，可推測其分子式為C27H30O16，失去C12H21O9，形成二級碎片例子m/z300.027 8[M-H-C12H21O9]-，失去C12H22O9、CO，形成二級碎片離子m/z271.025 1[M-H-C12H22O9-CO]-、m/z243.029 8[M-H-C12H22O9-CO-CO]-，失去C12H22O9、CO、C7H5O2、CO2，形成二級碎片離子m/z151.003 2[M-H-C12H22O9-CO-C7H5O2]-、m/z107.012 9[M-H-C12H22O9-CO-C7H5O2-CO2]-、m/z255.030 0[M-H-C12H22O9-CO2]-；根據文獻報道及對照品比對后確定該化合物為蘆丁，其二級碎片圖及裂解規律簡圖4、5。

圖4 蘆丁二級質譜圖

3.2 苯丙素類化合物裂解途徑

苯丙素類化合物是形成木質素的前體，在杜仲葉中含量較高。通過參考文獻及對照品比對從杜仲葉中鑒定出了9種苯丙素類化合物。以化合物36為例，在負離子模式下形成準分子離子峰為m/z353.088 2[M-H]-，推測其分子式為C16H18O9，在二級質譜中，依次丟掉C9H6O3、H2O形成碎片離子m/z191.055 8[M-H-C9H6O3]-、m/z173.045 0[M-H-C9H6O3-H2O]-；連續脫掉C7H10O5、CO2形成碎片離子m/z179.034 6[M-H-C7H10O5]-、m/z135.044 5[M-H-C7H10O5-CO2]-；根據文獻報道及對照品比對后確定化合物36號為綠原酸，其二級碎片圖及裂解規律如圖6、7所示。

圖5 蘆丁質譜裂解途徑

圖6 綠原酸二級質譜圖

圖7 綠原酸質譜裂解途徑

3.3 環烯醚萜類化合物裂解途徑

環烯醚萜類化合物的裂解表現為中性失去母環上的功能基團H2O、CO2、CH3COOH和糖單元等以及糖苷鍵斷裂，中性丟失葡萄糖殘基(-C6H10O5，-Glu)或葡萄糖(-C6H12O6，-Gluconse)。在負離子模式下從杜仲葉中共鑒定出2種環烯醚萜類：化合物22和38。以化合物22為例，在負離子模式下的準分子離子峰為m/z373.114 3[M-H]-，推測出其分子式為C16H22O10，脫去葡萄糖殘基得m/z211.061 1[M-H-Glu]-，后再脫去CO2、H2O形成碎片離子m/z167.071 0[M-H-Glu-CO2]-、m/z123.044 4[M-H-CO2-CO2]-、m/z193.050 7[M-H-Glu-H2O]-、m/z149.060 2[M-H-Glu-H2O-CO2]-；根據文獻報道及對照品比對后確定化合物22為京尼平苷酸。其二級碎片圖及裂解規律圖如圖8、9示。

圖8 京尼平苷酸二級質譜圖

圖9 京尼平苷酸質譜裂解途徑

3.4 有機酸類化合物裂解途徑

有機酸是一類具有羧基，酚羥基等酸性基團有機化合物。二級質譜裂解特征主要為先失去糖苷、酰基，而后丟掉CO、OH、H2O、CO2、HCOOH等中性分子，從杜仲葉中共鑒定出21種有機酸類化合物。以化合物6為例，其在負離子模式下形成準分子離子m/z191.055 8[M-H]-，推測其分子式為C7H12O6；在二級質譜中，丟掉H2O、HCOOH、CO形成碎片離子m/z173.055 8[M-H-H2O]-、m/z127.039 3[M-H-H2O-HCOOH]-、m/z85.028 6[M-H-H2O-HCOOH-H2O-CO+H]-。根據文獻報道，確定化合物6為D-(-)-奎尼酸。其二級碎片圖及裂解規律圖如圖10、11所示。

圖10 D-(-)-奎尼酸二級質譜圖

圖11 D-(-)-奎尼酸質譜裂解途徑

3.5 香豆素類化合物裂解途徑

香豆素指含有苯駢α-吡喃酮母核的肉桂酸型衍生物，具有芳香氣味。根據取代基的不同可分為簡單香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素以及其他香豆素類。盡管香豆素取代位點和取代基不同，但它們的斷裂模式具有一定的規律。香豆素的基本骨架很難被斷裂，主要是通過丟失-CH3、-CO、-CO2和H2O等小分子基團來產生碎片離子。本實驗共鑒定了5種香豆素類成分。以化合物47為例，在正離子模式下準分子離子峰為m/z163.039 1，可推測其分子式為C9H6O3，在正離子模式下失去H2O、CO分別形成二級碎片離子。m/z135.044 2[M+H-CO]+、m/z107.049.5[M+H-2CO]+、m/z117.033.8[M+H-2CO-H2O]+、m/z145.028 5[M+H-H2O]+、m/z89.039 2[M+H-2CO-H2O]+，根據參考文獻比對推測出該化合物為7-羥基香豆素。其二級碎片圖及裂解規律如圖12、13所示。

圖12 7-羥基香豆素二級質譜圖

圖13 7-羥基香豆素質譜裂解途徑

3.6 其他類化合物裂解途徑

其他類化合物共鑒定出16種。以化合物10為例，其在負離子模式下可形成準分子離子m/z191.019 4[M-H]-，可推測其分子式為C6H8O7；在二級質譜中，可推測其丟失H2O、CO2、C2H2O形成碎片離子m/z173.009 0[M-H-H2O]-、m/z129.018 6[M-H-H2O-CO2]-、m/z111.008 0[M-H-H2O-CO2-H2O]-、m/z87.007 9[M-H-H2O-CO2-C2H2O]-；根據文獻報道可推測出該化合物為檸檬酸，其二級碎片圖及裂解規律圖如圖14、15所示；化合物3在正離子模式下準分子離子為m/z127.039 2[M+H]+，推測其分子式為C6H6O3，二級質譜中依次失去H2O，CO形成碎片離子m/z109.028 8[M+H-H2O]+、m/z81.034 1[M+H-H2O-CO]+，根據文獻報道確定化合物3為5-羥甲基-2-糠醛。其二級碎片圖及裂解規律圖如圖16、17所示。

圖14 檸檬酸二級質譜圖

圖15 檸檬酸質譜裂解途徑

圖6 5-羥甲基-2-糠醛二級質譜圖

圖17 5-羥甲基-2-糠醛質譜裂解途徑

3.7 喬林與葉林杜仲葉主成分分析

將上述杜仲葉樣品63個共有成分的峰面積導入SIMCA14.1軟件，通過主成分分析初步判斷各樣本的聚集情況，反映組內和組間差異。PCA擬合的模型R2X=0.954，Q2=0.745，均>0.5，表明該模型具有較好的預測能力。由PCA得分圖(見圖18)可看出，旺蒼喬林杜仲葉、旺蒼葉林杜仲葉、通江喬林杜仲葉和通江葉林杜仲葉各自都能很好地聚為一類，且喬林杜仲葉與葉林杜仲葉在t[1]主成分方向區分明顯，葉林杜仲葉分布在t[1]軸右側，喬林杜仲葉分布在t[1]軸左側。

圖18 杜仲葉PCA得分散點圖

3.8 喬林與葉林杜仲葉正交偏最小二乘法-判別分析

為了更好地突出喬林杜仲葉與葉林杜仲葉的組間差異，尋找差異成分，將杜仲葉樣品中63個共有峰峰面積導入SIMCA14.1軟件，進行有監督的正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)。采用常用變量重要性投影(VIP)值反映代謝物對組分的貢獻性大小，一般認為VIP>1的變量對組分有顯著貢獻，OPLS-DA擬合的模型R2X=0.735，R2Y=0.95，Q2=0.867，均>0.5，表示該模型的預測能力較強，可以作為兩種栽培方式杜仲葉的模式識別方法，杜仲葉樣品OPLS-DA得分散點圖如圖19所示。VIP結果見圖20，最終在正負離子模式下共篩選出10個差異性成分，分別是D-(-)-奎尼酸、檸檬酸、α，α-海藻糖、葡萄糖酸、蘆丁、3，4-二甲基苯甲酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、4-甲基傘形酮、4，5-二咖啡酰奎寧酸、3′，4′-二羥基苯丙酮，這些成分可作為區分喬林與葉林杜仲葉的特征性成分。

圖19 杜仲葉OPLS-DA得分散點圖

圖20 不同栽培方式杜仲葉差異成分VIP圖

3.9 統計學分析

為比較上述對兩種栽培方式影響較大的10種成分是否具有顯著差異，采用SPSS24.0軟件，對10種差異成分色譜峰的峰面積進行兩獨立樣本t檢驗，P<0.05表示具有顯著差異，以峰面積為縱坐標，主要差異成分為橫坐標，繪制喬林和葉林杜仲葉差異成分柱形圖。

由圖21可知，兩種栽培方式中的主要差異成分葡萄糖酸(1)、D-(-)-奎尼酸(6)、檸檬酸(10)、蘆丁(51)、4，5-二咖啡酰奎寧酸(56)在喬林杜仲葉中含量相對較高，而葉林杜仲葉中α，α-海藻糖(2)、3，4-二甲基苯甲酸(31)、3′，4′-二羥基苯丙酮(15)、4-甲基傘形酮(20)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(53)的含量相對較高。其中D-(-)-奎寧酸、檸檬酸、3′，4′-二羥基苯丙酮、4-甲基傘形酮、4，5-二咖啡酰奎寧酸在兩種栽培方式中的杜仲葉中存在顯著差異，可見喬林與葉林杜仲葉中的主要成分存在有明顯差異。

圖21 不同栽培模式杜仲葉差異成分比較

3 討論與結論

本文采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術對喬林與葉林杜仲葉代謝輪廓和差異成分進行了全面分析。共鑒定了62個化合物，其中包括其9種黃酮類成分，9種苯丙素類成分，2種環烯醚萜類成分，21種有機酸類成分，5種香豆素類成分和16種其他類成分，其中香豆素類成分對香豆醛、7-羥基香豆素、6，7-二羥基香豆素、香豆素、4-甲基傘形酮為首次在杜仲葉中發現的成分，這些成分可能與其抗腫瘤和抗骨質疏松效果密切相關。

兩種栽培方式下杜仲葉化學成分基本一致，但相對含量上存在差異，其中存在顯著差異成分包括D-(-)-奎尼酸、檸檬酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸、3′，4′-二羥基苯丙酮、4-甲基傘形酮。其中D-(-)-奎尼酸、檸檬酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸在喬林杜仲葉中含量相對較高，3′，4′-二羥基苯丙酮、4-甲基傘形酮在葉林杜仲葉中含量相對較高。這些成分在含量上的差異可作為區分喬林與葉林杜仲葉的特征性成分。其中D-(-)-奎尼酸為對映純化合物如綠原酸、咖啡酰奎尼酸等合成中有用的手性源[28]，4，5-二咖啡酰奎寧酸具有抗氧化、抗炎等生物活性[29]，4-甲基傘形酮具有抗炎、抑制透明質酸等作用[30,31]，因此建議將D-(-)-奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸、4-甲基傘形酮作為區分喬林與葉林杜仲葉的質量控制指標成分。現代藥理研究表明D-(-)-奎尼酸具有增強膽汁降低脂肪，肝臟解毒，預防脂肪肝的作用[32]；4，5-二咖啡酰奎寧酸具有益氣養陰，活血健腦的功效，用于治療氣陰兩虛及心腦血管疾病等[33]，4-甲基傘形酮是一種透明質酸生物合成抑制劑，在體外具有一定程度的抗菌能力，在細胞水平具有腫瘤抑制作用[34]。本研究將喬林與葉林的杜仲葉區分開來，有利于更好地應用不同栽培方式下的杜仲葉的優勢成分，為杜仲葉產品綜合開發利用提供了一定的理論基礎。

本研究采用超高效液相-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜法只能通過準分子離子及多級碎片離子對化合物進行預測，對于存在的同分異構體還需要進一步結合核磁共振技術進行鑒定。文獻報道[7,8]，不同采收期、不同產地、不同樹齡杜仲葉中成分具有差異性，下一步將通過UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術對不同產地、不同采收期、不同樹齡杜仲葉中全成分進行比較研究，為杜仲葉品質評價奠定基礎。