391714例新生兒先天性腎上腺皮質增生癥篩查與基因檢測

徐鈺琪 林彩娟 耿國興 李威 陽奇 羅靜思

1廣西壯族自治區婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室（南寧 530012）；2廣西出生缺陷預防控制研究所（南寧 530012）；3廣西生殖健康與出生缺陷防治重點實驗室（南寧 530012）

先天性腎上腺皮質增生癥（CAH）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于腎上腺皮質在合成人體必需的鹽皮質激素、糖過程中，某些酶（21-羥化酶、11β-羥化酶、3β-羥類固醇脫氫酶等）的先天性缺陷導致的腎上腺皮質功能減退，其中，21-羥化酶最常見，約占90%以上［1］，可在生后2 周內出現嚴重失鹽癥狀、甚至死亡；同時，CAH 還可造成體內雄性激素水平的異常增高，導致女性男性化及男性假性性早熟、成年后身材矮小等。因CYP21A2 基因缺陷會引起CYP21（21-羥化酶）活性喪失，CAH 患兒體內17-羥孕酮（17-OHP）水平會明顯升高，因此早期進行新生兒疾病篩查聯合CYP21A2 基因檢測可有效檢出患兒，減輕CAH 導致的嚴重后果。為了解本地區的CAH 篩查情況與21-OHD 熱點變異位點及基因檢測結果，回顧分析近7年來的臨床資料，以期提高對新生兒CAH 篩查的認識和陽性患兒的診治能力，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2015-2021年在廣西新生兒疾病篩查中心管轄范圍內的168 家助產醫院出生的391 714 例活產新生兒為研究對象，按照《新生兒疾病篩查血片采集技術規范》的要求采集足跟血，送至廣西新生兒疾病篩查中心行17a-OHP 濃度值檢測。采用EDTA抗凝管抽取患兒及其父母外周血各2 mL，提取DNA，采用Sanger 測序和MLPA（多重連接探針擴增技術）行CYP21A2基因檢測。本研究通過廣西壯族自治區婦幼保健院倫理委員會批準，所有檢查均征得患兒家屬或監護人簽署同意告知書。

1.2 研究方法

1.2.1 CAH 篩查新生兒CAH 篩查常用的是時間分辨免疫熒光法［2］，2015年1月至2019年8月切值根據試劑盒說明書≥30 nmol/L 為陽性，2019年9月起試劑盒升級后切值調整為17-OHP 檢測值≥11 nmol/L 的足月兒（≥37 周）、早產兒（＜37 周）17-OHP 檢測值≥26 nmol/L 者為陽性，對于可疑的新生兒，進行二次召回復查血片行下一步的確診。

1.2.2 CAH 診斷中華醫學會兒科學分會內分泌遺傳代謝病學組在《先天性腎上腺皮質增生癥21-羥化酶缺陷診治共識》提出CAH 診斷臨床譜帶寬，主要依據臨床表現、內分泌激素檢查和影像學相關輔助檢查綜合判斷，必要時應用基因診斷［2］。（1）臨床表現：失鹽表現（低鈉低血容量的休克）、高雄激素血癥（不同年齡表現不一，女性男性化、男性性早熟）及皮膚或黏膜色素加深，以乳暈和外陰明顯，部分嬰兒可無此改變。（2）輔助檢查：17-羥孕酮增高；血清皮質醇低下伴ACTH 增高（也有21-OHD 患者皮質醇正常）；雄激素升高（需按照年齡、性別和青春期發育判斷不同的參考值）；出生性別模糊者行B 超檢查明確有無子宮及性腺；外生殖器畸形者行染色體核型分析；由于臨床譜帶寬，對臨床不能診斷21-OHD 或者需與其他疾病鑒別時，必須做基因診斷確診，可以聯合Sanger 測序和MLPA 技術進行CYP21A2 基因診斷。

1.3 統計學方法資料采用Excel 軟件錄入資料整理，計數資料以例數和百分數表示。

2 結果

2.1 新生兒CAH 篩查情況2015-2021年間，轄區內新生兒活產數共計1 014 108 例，CAH 共篩查391 714 例，總篩查率為38.63%。CAH 篩查陽性1 769 例，陽性率為0.45%，確診CAH 患兒21 例，發病率為1/18 653（0.053 6‰），見表1。發病情況與全國各地區相比較存在差異，見表2。

表1 2015-2021年新生兒CAH 篩查及確診情況Tab.1 Screening and diagnosis of neonates CAH from 2015 to 2021

表2 廣西與各地區CAH 發病情況的比較Tab.2 Comparison of CAH incidence between Guangxi and other regions

2.2 確診CAH 患兒情況

2.2.1 病例資料確診的21 例CAH 患兒中，平均胎齡為37+5周，診斷平均年齡9.86 d，最小2 d，最大27 d。初篩血17-OHP 濃度在31～972 nmol/L 之間，見表3。

2.2.2 CYP21A2基因檢測結果21例患兒中除2例因放棄治療未行基因檢查外，其余19 例均對CYP21A2 基因進行檢測，所有確診患兒均發現相關基因變異，同時對患兒父母進行驗證，檢測到父母相同等位基因上CYP21A2 變異。見表3。

表3 21 例CAH 患兒臨床資料Tab.3 Clinical data of 21 children with CAH

3 討論

先天性腎上腺皮質增生癥（CAH）是由于腎上腺皮質激素合成過程中酶缺陷引起的常染色體遺傳病，其中以編碼21-OHD 的CYP21A2 基因的變異最常見，新生兒疾病篩查主要針對21-羥化酶缺乏篩查，由于21-羥化酶缺乏，腎上腺皮質激素生物合成通路受阻，導致對垂體促腎上腺皮質激素分泌的負反饋抑制作用減弱，從而使腎上腺皮質激素前體物質17-羥孕酮堆積，血17α-OHP 的升高是21-OHD 早期診斷的特異性指標和主要監測指標。

我國目前的CAH 篩查率是30%～35%［8］，本新篩中心通過不斷的推廣與宣傳，篩查率從2015年的33.6%到2021年的42.9 %，呈逐年上升的趨勢，但整體篩查率也較低，要努力通過多渠道提高篩查率。全世界CAH發生率約為1/10 000～1/20 000［9-13］，本研究中CAH 發生率為1/18 653，與國內報道的相比較，發病率低于重慶1/18 000［14］，江蘇宿遷1/17 298［7］，山東淄博1/16 234［3］，寧夏1/14 550［15］，高于上海1/18 795［16］，江西宜春1/20 076［4］，江蘇揚州1/22 207［5］，四川1/32 326［6］。本研究通過對391 714例新生兒篩查，在篩查陽性樣本召回的1 559 例新生兒中檢出21 例患兒，陽性預測值為1.37%，與全國各地區對比，也有差異，有文獻報道［17-20］，新生兒17α-OHP 濃度水平與其出生體質量、胎齡、用藥、營養、地域、采血時間等因素有關，不同胎齡的出生低體重兒與正常體重兒的17α-OHP 濃度有差異，早產兒的濃度會高于足月兒，這樣就會造成假陽性過多，只用一個切值去判斷陰陽性會對結果造成誤判，增加不必要的召回壓力及家長的焦慮，所以在17α-OHP 的免疫測定中應該制定不同影響因素下的切值，提高確診率。也有研究報道，液相色譜-串聯質譜技術可將CAH 篩查的陽性預測值提高30%～100%［21］。但是由于該技術標本處理操作復雜，自動化程度低，目前還未能大規模運用于臨床。在本研究病例中，21 例患兒檢出年齡在2～27 d，真正做到了在患兒出現嚴重癥狀前對嬰兒早期診斷并及時治療和規范化管理，大大降低新生兒腎上腺危象對患兒的影響及性別的錯誤判斷，降低病死率。

CAH 發病率低，臨床表現復雜缺乏特異性，不易察覺且易誤診漏診，17α-OHP 升高可高度提示21-OHD，基因檢測則可對其確診。CAH 的致病基因是21-羥化酶基因，該基因位于人類第6 號染色體短臂6p21.3 的HLA Ⅲ類基因區。21-羥化酶CYP21A2 基因的變異鑒定是在聯合Sanger 測序和MLPA 技術從分子水平進行分析，是對篩查結果的確診與補充；基因測序能檢出基因點突變，但對大片段缺失和重復可能漏診，MLPA 可同時檢測多個不同核苷酸序列的缺失重排及拷貝數變化，聯合兩種技術可取長補短明顯提高該基因的陽性率。根據人類基因變異數據庫發現，迄今引起CYP21A2 基因的變異大約有300 種［22］，一般分為3 種類型：（1）點變異；（2）大片段基因缺失和基因轉換；（3）自發變異。所以本病在近親結婚的后代中發病率相對較高。90%的CAH是由于21-OHD活性喪失所致，基因變異程度越重，酶活性越低，表現出越重的腎上腺危象，出生早期就會發生嚴重的電解質紊亂和性分化異常；本研究病例中，有兩例患兒的17α-OHP 濃度高達914 nmol/L 和818 nmol/L，臨床表現為嚴重的高鉀低鈉、脫水、假兩性畸形，皮膚色暗合并嚴重的呼吸衰竭、病情惡化危重，臨床癥狀支持CAH 的診斷，最終因家屬放棄治療，未能行基因檢測；其余19 例患兒經基因檢測發現均存在CYP21A2 基因的不同變異，發現了多種變異類型：剪接變異、錯義變異、無義變異和大片段缺失等。在檢出的外顯子缺失中，E1-E7 缺失患兒的17α-OHP 濃度為955 nmol/L，E1-E3 缺失患兒的17α-OHP 濃度為972 nmol/L 和398 nmol/L，E3-E4缺失患兒的17α-OHP 濃度為604 nmol/L，平均濃度為732.25 nmol/L，其他點突變的患兒17α-OHP 濃度相對較低，這可能與殘余酶活性有關，CYP21A2基因的不同突變可使得CYP21 活性喪失不同，突變程度越重，癥狀也越重。但仍有少數酶缺失與基因型表型不一致的情況，其原因可能與新生兒出生時激素水平不穩定，采血時間等因素影響了酶活性有關。

在基因突變頻率方面，19 例患兒中檢出6 例c.293-13A/C＞G，占比33%，4例IVS2-13A/C＞G，占比22.2%，3 例c.518T＞A（p.I173N），占比16.67%，2 例c.955C＞T ，占比11.11%及外顯子缺失；由此發現，CYP21A2 基因變異的類型多樣化，c.293-13A/C＞G是本地區的熱點變異，與國內報道的四川?。?3］、河南?。?4］、湖南［25］、徐州［26］檢出的熱點變異位點一致，也是國內較常見的變異位點；其次為IVS2-13A/C＞G ，這兩種點突變I2G 導致RNA 剪接發生異常，引起純合突變或雜合突變，在本組病例中剪接突變占55.2%。與國外相關的基因檢出情況對比發現，CYP21A2 基因有地區和種族之間的差異［27-28］，不同群體間的基因變異譜和熱點頻率不盡相同，越南［29］對212 例患者分析發現以缺失變異為主，第二位才是c.293-13A/C＞G 變異；FINKEL STAIN 等［30］報道的166 例患者亦是如此。聯合Sanger 測序和MLPA 技術對CYP21A2 基因變異的應用在是一種特異、可靠的基因檢測手段，能有效檢出基因變異和大片段缺失，對本組病人檢出率高。湖南［25］地區通過對48 例確診21-羥化酶缺乏癥患兒行基因檢測中，檢出基因陽性44 例，陽性率為91.7%；楊海花等［24］對55 例患兒行基因檢測中，檢出基因陽性53 例，陽性率為96.36%；不排除某些新發變異未被檢出，還需要進一步的驗證。

綜上，CAH 作為一種遺傳性疾病，初次篩查陽性的新生兒，需進一步確診。以ELISA、TRFIA 作為CAH 一級篩查方法的，確診時需補充生化檢測，典型的21-OHD 表現較為顯著，且也相對較容易進行診斷，而對于臨床疑似而生化診斷困難者，或診斷不明已用糖皮質激素的非典型的21-OHD，一般只表現出輕微的高雄激素體征，難與類似癥狀的疾病鑒別，因此，有必要借助基因診斷來明確。本研究通過對CYP21A2 基因檢測來明確本病的基因型，因此通過CYP21A2 基因檢測進一步證實了臨床和生化診斷；基因檢測是CAH 確診的金標準，由于CYP21A2 與無功能的假基因CYP21A1的高度同源，CYP21A2 基因結構性變異的復雜性，有必要進行父母的CYP21A2 分析和測序，用于確定突變情況，通過聯合Sanger 測序和MLPA 技術對胎兒進行檢測，根據父母或先證者的基因檢測結果，判斷胎兒的基因型，可以有效避免拷貝數變異所導致的誤診，指導臨床治療及判斷預后，更為重要的是，根據遺傳規律能夠對患兒父母的再生育風險提供前瞻性指導。本研究也存在不足之處，由于病例數有限且確診的病例均是新生兒，缺少成人的相關病例，對本地區的21-OHD 和CYP21A2基因變異結果分析可能造成偏差，為了獲得更準確的獲得基因譜，有待進一步擴大研究對象累積相關病例。