非編碼RNA調節糖尿病狀態骨再生的研究進展

董驍懿 李昊

1廣西醫科大學口腔醫學院口腔修復科（南寧 530021）；2廣西口腔頜面修復與重建研究自治區級重點實驗室（南寧 530021）

外傷、感染、腫瘤、骨骼系統異常等原因導致的骨缺損愈合不良嚴重影響患者的身心健康，骨再生醫學致力解決這一問題，促進骨組織修復再生。骨再生是一個動態的過程，需要多種細胞和因子的參與。炎癥細胞是骨缺損環境中的初始細胞成分，隨后在骨愈合中發揮功能的是間充質干細胞、內皮細胞、軟骨細胞、成骨細胞，最后破骨細胞進行骨重塑［1］。骨免疫與慢性炎癥性疾病密切相關，免疫細胞如巨噬細胞和成骨相關細胞共用相同的微環境，相互作用、協同行使“骨免疫”的功能［2］。糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰島素分泌缺陷、胰島素抵抗或兩者共同引起的一組以高血糖為特征的慢性代謝性疾病。我國是糖尿病患病率增長最快的國家之一，目前我國成人糖尿病患病率達11.2%，約有糖尿病患者1.3 億例［3-5］。糖尿病還會伴發相關骨疾病，如骨質疏松、骨折風險增加、骨延遲愈合等，嚴重影響患者的生存質量。這些可能與糖尿病狀態下鈣磷流失、維生素D 的缺乏、晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）的毒性、微血管功能受損和慢性炎癥有關［6］。

ncRNAs（non-codingRNAs，ncRNAs）是從基因組轉錄而來，但不參與翻譯蛋白質，大約有98%的RNA 無編碼或者低編碼能力。非編碼RNA 按照其功能可分為管家非編碼RNA 和調節非編碼RNA。管家非編碼RNA 是細胞生存必須的RNA，其含量相對恒定，主要包括參與蛋白質翻譯的rRNAs、負責轉運氨基酸的tRNAs、對RNA 前體進行加工的snRNAs 和加工細胞核中前體rRNAs 的snoRNAs。調節非編碼RNA 主要包括小分子RNA（microRNAs，miRNAs）、長鏈非編碼RNA（longnoncodingRNAs，lncRNAs）和環狀RNA（circRNAs），參與細胞調控［7］、表觀遺傳［8］、骨再生［9］、腫瘤和糖代謝［10］等過程。內源競爭RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）如circRNAs 和lncRNAs 可以作為miRNAs 海綿，通過競爭miRNAs 的結合位點從而抑制miRNAs 對其目標mRNAs 的調控。

近年來，ncRNAs 在骨再生等領域研究得到廣泛重視，非編碼RNA 在骨再生等疾病的研究主要是指miRNAs、lncRNAs 和circRNA 的作用。miRNAs 可以通過Wnt/β-catnein 信號通路、dkk3 基因的表達調節骨髓間充質成軟骨和成骨分化［11-12］。最初關于miRNA 對骨生物學的影響是通過刪除Dicer 酶可以觀察到的，GRILLARI 等［13］認為，Dicer酶加工過的miRNA 在調控胎兒期和出生后的骨形成中起關鍵作用，miRNA 可以調節成骨細胞、骨髓間充質干細胞、巨噬細胞和破骨細胞的功能，同時與糖尿病狀態下的骨質疏松密切相關。多種lncRNAs 作為潛在的生物標志物，可以調控成骨細胞的分化［14］有望成為骨代謝疾病的新型診斷和治療方法。ANRIL 是一種lncRNA，KONG 等［15］發現，ANRIL 不僅與癌癥密切相關，同時可能影響與2 型糖尿病、骨骼的大小、骨礦化程度以及骨密度密切相關。目前，隨著相關研究的深入，越來越多研究表明ncRNAs 也可以調節糖尿病狀態下骨缺損愈合，這為糖尿病狀態骨缺損再生的診斷和治療提供新的可能性。

1 microRNAs 調控糖尿病狀態骨再生

microRNAs 是大小為19～25 個核苷酸的短核糖核酸分子，在調節目標基因的轉錄后沉默［16］。自1993年在秀麗隱桿線蟲中發現miRNAs，越來越多研究表明miRNAs 是真核生物中調節生物過程的關鍵物質。miRNAs 幾乎參與所有細胞的生物過程，與mRNAs 中互補序列結合后mRNAs 翻譯被抑制或被降解［16］。miRNAs 數量多，單個miRNA 可調節數百個mRNAs，大約可以調控人類生物體中1/3的基因。近年來關于miRNAs 的基因治療的研究發展迅速，目前大量miRNAs 模擬物和miRNAs 抑制劑處于研發階段，這種治療策略有望成為新的治療藥物在促進糖尿病骨再生中發揮巨大的潛力。

在糖尿病大鼠下頜骨中miR-221-3p 和miR-222-3p 的表達上調，通過IGF-1 調節ERK 的表達從而抑制骨髓間充質干細胞成骨分化，下調miR-221-3p 和miR-222-3p 的表達可能促進成骨［17］。當過度表達miR-449 時，通過Sirt1/Fra-1 信號通路抑制高糖和游離脂肪酸環境下骨髓充質干細胞的成骨分化［18］。本課題組研究發現，抑制miR-203-3p的表達，可以改善糖尿病小鼠種植區的骨形成，可能與調節Smad 信號通路及成骨相關因子表達有關［19］。在高糖條件下骨細胞攜帶含miR-124-3p 的細胞外囊泡，可以調節牙槽骨成骨細胞中Gal-3的表達［20］。JIANG 等［21］發現miR-26a 可以調節葡萄糖代謝，同時改善糖尿病小鼠胰島素抵抗和糖耐量，改善骨微結構和質量，促進成骨細胞成骨和減少破骨細胞的分化。

胰島β 細胞的主要功能是調節葡萄糖代謝，DUMORTIER 等［22］發現人和大鼠的胰島細胞過度表達miR-375 會減弱胰島β 細胞對血糖的調節作用，并且可能是糖尿病狀態胰島β 細胞特征消失的因素之一。同時HE 等［23］發現，大鼠產前咖啡因暴露可能通過miR-375/CTGF 通路導致H 型血管成管不良，進而相關長骨發育不良。間充質干細胞是哺乳動物中多向分化的細胞，可以分化為骨、軟骨、神經、脂肪等細胞。有趣的是，同樣有研究發現，將人脂肪間充質干細胞分泌的過度表達miR-375 的外泌體制成水凝膠載體，應用于大鼠顱骨缺損模型，影像學和組織學均顯示骨再生能力增加，其機制可能為IGFBP3 通過與其3′UTR 結合而被抑制，從而改善骨髓間充質干細胞的成骨向分化［24］。這一截然不同的結果，可能是與miR-357 在不同組織與細胞中的顯示出來功能的不同作用有關，也可能與不同表達劑量有關。miR-17-92在骨組織和成骨細胞中高表達，缺少miR-17-92 簇，引起成骨細胞增殖分化下調［25］；基因工程小鼠胰島β細胞中miR-17-92缺失，糖耐量水平降低促進糖尿病的發展［26］。

QU 等［27］發現在體外模擬2 型糖尿病miR-155水平顯著升高，miR-155 過表達可顯著抑制堿性磷酸酶活性和Runx2 和OCN 的水平，將miR-155 和miR-155 抑制劑分別轉染至人骨髓間充質干細胞中得出相反的結果。miR-155 不僅與糖尿病狀態下骨髓間充質干細胞成骨分化相關，還參與巨噬細胞的極化。巨噬細胞是一類具有可塑性的先天免疫細胞，參與骨缺損愈合的全部階段，影響骨再生。促炎破骨型M1 型巨噬細胞在清除壞死、凋亡細胞和入侵的病原體方面起著關鍵作用，抗炎成骨型M2 型巨噬細胞促進炎癥消退、組織穩態平衡和損傷修復［28］。miRNAs 可以調節巨噬細胞的極化從而影響骨再生的過程。KANG 等［29］研究發現，在M1 極化的巨噬細胞細胞外囊泡中miR-155 的表達顯著增加；M2 極化巨噬細胞胞外囊泡的miR-378a增加，提示抑制miR-155 的表達可能同時促進巨噬細胞向M2 型極化以及促進骨髓間充質干細胞成骨向分化。

2 lncRNAs 影響糖尿病狀態下成骨

lncRNAs 是高度結構化的RNA 轉錄物，長度在200～1 000 個核苷酸之間。H19 是第一個被檢測出來的lncRNA，最初將它歸類于mRNAs，直到20世紀90年代發現XIST 之后lncRNAs 的功能才得到充分的闡述［30］。lncRNAs 可以折疊成具有非常復雜的二級和三級結構，有著與mRNAs 相同的降解過程［31］，lncRNAs 幾乎存在于所有的細胞中。目前，研究發現lncRNAs 的作用機制主要為：作為信號傳導因子參與信號傳導、與轉錄因子結合形成復合物調節DNA 的表達、通過海綿miRNAs 調控mRNAs 的表達以及多種轉錄因子與lncRNAs 結合實現不同信號通路之間信息交匯調節正常與疾病狀態下的生物過程［32］。隨著lncRNAs 成為最新的研究熱點，lncRNAs 在促進糖尿病狀態骨再生有望成為新的潛力調控分子。

高糖可以抑制lncRNA AK028326 介導的CXCL13 的表達，抑制骨髓間充質干細胞的成骨分化，研究發現過表達AK028326 可以逆轉高糖狀態骨髓間充質干細胞成骨向分化被抑制的狀態［33］。

YU 等［34］發現lncRNA-Dnm3os，可能通過神經生長因子調節小鼠ATDC5 細胞生長以及能夠維持軟骨細胞的增殖，并抑制軟骨細胞的過早分化。同樣ZHOU 等［35］研究表明Dnm3os 可以直接與miR-127-5p 結合，通過調節GREM2，蛋白多糖的沉積和軟骨分化標記物的表達下降，大鼠骨髓間充質干細胞的軟骨分化被抑制。但是，當lncRNA Dnm3os 表達增高進而與核仁蛋白相關的作用中斷時，促進糖尿病狀態下巨噬細胞的炎癥反應［36］。綜上所述，雖然有證據表明lncRNA-Dnm3os 可能促進骨骼發育，但是有可能加重糖尿病患者的炎癥反應而帶來負面作用。

ANRIL 是位于CDKN2A/B 基因座上的反義lncRNA 序列，CDKN2A/B 與人類癌癥與代謝性疾病相關。ANRIL 可以抑制經LPS 誘導的HBMSCs 的成骨分化，HAMSCs 通過ANRIL/miR125a/APC/β-連環蛋白信號軸促進脂多糖誘導的HBMSCs 的成骨分化［37］。CURTIS 等［38］發現臍帶CDKN2A 甲基化水平增加與兒童骨的大小、礦物質含量和密度的降低有關，同時CDKN2A/B 與2 型糖尿病和妊娠期糖尿病風險增高相關［39-40］，NAZARI 等［41］發現妊娠期糖尿病大鼠GDKN2A/B 低甲基化，子代CDKN2A/B mRNA 和蛋白質水平增高、胰腺β 細胞的功能損傷。ANRIL 是否可以通過調節CDKN2A/B 的表達改善糖尿病狀態下骨再生水平仍需要實驗對此進行研究。

3 cricRNAs 影響骨再生過程

隨著高通量測序和生物信息學技術的發展大量的circRNAs 被發現，在哺乳動物細胞中的circRNAs 具有數量豐富、穩定性高、組織特異性和階段特異性的特點，因為有穩定的環狀結構而比線性RNA 穩定，可以防止核酸外切酶的降解。circRNAs 可以通過影響線性同源物的剪切、調節轉錄與剪切的過程、與蛋白質結合形成circRNPS 在疾病的發生和發展中發揮著重要的作用，某些病毒中circRNAs 同樣可以翻譯蛋白質［42］。近年來circRNAs 成為ncRNAs 研究的最新熱點，但相關研究起步較晚、文章較少，而且目前尚未有關于circRNAs 在糖尿病狀態骨缺損愈合中作用的研究報道。以下為數種已報道可以同時影響糖尿病和骨再生circRNAs，但是否可以在糖尿病狀態下影響成骨，仍有待進一步研究。

p21 參與糖尿病的過程，可以改善糖尿病狀態。有實驗表明MPK38/MELK 通過對p21 的Thr55磷酸化，能夠改善飲食誘導的肥胖小鼠的葡萄糖、脂質和能量代謝缺陷［43］。CircRNA 25487 通過海綿miR-134-3p 作用使p21 的表達下降、骨髓間充質干細胞和破骨細胞增殖被抑制，阻礙股骨頭壞死的骨修復［44］。

CSF1 處理過的Csf1op/op 小鼠巨噬細胞密度顯著高于未處理組Csf1op/op 小鼠，全身使用CSF1糖尿病Csf1op/op 小鼠的TNF、IL-6 等炎癥因子表達增多［45］。circRNA 28313 和miR-195a、CSF1 形成ceRNAs 網絡，下調circRNA 28313 的表達可以顯著抑制RANKL + CSF1 誘導的單核巨噬細胞破骨分化，同時抑制去卵巢小鼠的骨吸收［46］。

4 展望

因全身性疾病、外傷、外科手術等原因造成的骨缺損，往往超出骨的正常自愈潛力，同時糖尿病及相關并發癥嚴重阻礙骨組織再生。非編碼RNA在真核生物的生理以及病理過程中發揮重要的調控作用，與骨缺損再生顯示出了密切的相關性。多種ncRNAs 可以調節成骨，但ncRNAs 調控糖尿病狀態骨再生的研究成果較少，其機制尚未被完全闡釋。

miRNAs 作為最早被發現、研究成果最多的ncRNAs，可以直接與mRNAs 靶向結合調控基因的表達，在作為臨床藥物研發中具有較多的優勢。近年來lncRNAs 與circRNAs日漸成為ncRNAs 研究的熱點，因其特殊的結構不僅可以海綿miRNAs調控基因的表達，還可以通過調節組蛋白甲基化、調控靶蛋白的表達、調控轉錄、轉錄后調控等方式調節細胞和組織的功能和狀態，這似乎預示著lncRNAs 和circRNAs 在疾病的發生和發展中發揮著更復雜的作用，目前關于此方面的研究仍處于較初步的研究，后續研究可以從此方面繼續深入。CircRNAs 因其獨特的環狀結構可以逃避核酸外切酶的剪切作用，長期穩定的在血液、組織中存在，這也預示著circRNAs 成為疾病診斷的潛在biomarker 分子。因為ncRNAs 具有組織特異性、時空表達特異性的特點，在實驗研究與臨床試驗中需要考慮其對不同組織的不同調控方向可能引起的副作用。研究ncRNAs 調控糖尿病狀態骨再生，有望為糖尿病狀態下骨缺損的診斷和靶點治療提供新研究思路。