高糖對滑膜間充質干細胞衰老的影響

譚淑儀 劉宇薇 高海

1南方醫科大學口腔醫院盤福院區種植修復科（廣州 510180）；2南方醫科大學口腔醫院修復科（廣州 510280）；3南方醫科大學口腔醫院盤福院區（廣州 510180）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是世界上第四大致殘原因，主要病理特征為關節軟骨損傷和軟骨下骨硬化，包括軟骨退化、骨重塑、骨贅形成和滑膜炎癥［1-2］。2 型糖尿病患者骨關節炎的發病率為54%［3］，糖尿病預示著骨關節炎的預后不良［4］。研究表明，糖尿病所引起的炎癥反應和高糖環境促進了關節軟骨的破壞［5］，其發病機制尚未明確。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新、向軟骨分化和免疫調節的潛能，干細胞治療作為骨關節炎的一種再生細胞治療方法，是一種治療OA 的新策略［6-7］。MSCs 來源于骨髓、脂肪組織、骨骼肌、胎盤、臍帶、牙髓和滑膜等多種組織［8］。其中，取自滑膜組織的間充質干細胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSCs）向軟骨細胞分化及增殖的潛能更大，與其他來源的間充質細胞相比，SMSCs 具有優越的軟骨原性［9］，因而，SMSCs 在軟骨損傷修復中具有諸多優越性，在OA的治療中有重要的應用前景。

骨關節炎是糖尿病患者的常見并發癥。有研究發現，高糖環境下，滑膜SMCs 的軟骨分化能力比低糖培養條件下減弱［10］，但具體機制尚未闡明。干細胞衰老將對細胞功能產生影響，不僅可以導致炎癥微環境的產生，并對關節軟骨產生不利影響［6］。因此，本研究擬通過探究高糖對滑膜細胞衰老和生物學功能的影響，為SMSCs應用于糖尿病患者骨關節炎的治療提供風險評估依據。

細胞衰老的主要特點是細胞形態改變，細胞內衰老相關β-半乳糖苷酶含量升高，炎癥因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶類等衰老相關分泌表型SASP 表達上調，以及線粒體的分裂改變［11］。上述指標的改變與細胞進入衰老狀態有關，影響細胞的生物學功能，進一步影響體內微環境以及OA 的預后和轉歸。

1 材料與方法

1.1 主要材料大鼠滑膜間充質干細胞（賽百慷，中國）；細胞衰老半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天，中國）；CCK-8 細胞增殖活性檢測試劑盒（廣州晶欣，中國）；Mito-Tracker Red CMXRos 線粒體紅色熒光探針（碧云天，中國）；ELISA 試劑盒（武漢華美，中國）；Maxima TMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2X）（Thermo Fisher Scientific，美國）；總RNA提取試劑盒（Promega，中國）；反轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）；總蛋白提取試劑及BCA-100 蛋白定量分析試劑盒（上海博彩生物科技有限公司，中國）；P21（CPA4956）兔（Cohesion Biosciences，英國）；HRP 羊抗小鼠IgG（BA1050）及HRP 羊抗兔IgG（BA1054）（武漢博士德，中國）。本研究倫理審查編號：粵口醫倫審【2021】12 號。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及實驗分組收到大鼠SMSCs 后，帶培養瓶放置在37 ℃，體積分數為5%CO2培養箱中，2 h 后更換新的完全培養基，繼續培養24 h。完全培養基采用賽百慷配套原代間充質干細胞培養體系，由88%基礎培養基+10%胎牛血清+1%雙抗+1%細胞添加劑組成。待細胞融合率達80%～90%，胰酶消化1∶2進行傳代。實驗分組：高糖組：采用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培養基；對照組：采用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養基。

1.2.2 CCK-8 檢測細胞增殖活性將大鼠SMSCs P4 以每孔5 000 個細胞接種于96 孔板，設5 組復孔，24 h 待細胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L葡萄糖的完全培養基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養基，于24 h，每孔加入10 μL 的CCK 溶液，將孔板置于培養箱中孵育2 h，測定450 nm吸光度，使用酶標儀得到各組OD值。

1.2.3 細胞衰老β-半乳糖苷酶SA-β-gal 染色將大鼠SMSCs P4 以每孔2.9 萬個細胞接種于24 孔板，24 h 待細胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L葡萄糖的完全培養基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養基，培養24 h 后吸除細胞培養液，PBS 洗滌1 次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細胞固定液，用PBS 洗滌細胞3 次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 mL 染色工作液。37 ℃孵育過夜，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測（Real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）將大鼠SMSCs P4 接種于培養瓶中，24 h 待細胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培養基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養基，于24 h 收集各組細胞，提取總RNA，分光光度計檢測RNA 濃度和純度后逆轉錄為cDNA，使用特異性引物序列對基因進行聚合酶鏈反應擴增。使用ABI Step One QPCR 系統，設置反應條件，對各組mRNA 表達量進行分析。

1.2.5 Mito-tracter 染色將大鼠SMSCs P4 接種于共聚焦皿中，過夜待細胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培養基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養基，培養24 h，PBS 洗一遍，加入配制好的Mito-Tracter 培養基，放回37 ℃溫箱中，30 min 后取出，更換培養基，激光共聚焦顯微鏡鏡下觀察并拍照。

1.2.6 Western blot 檢測將大鼠SMSCs P4 接種于培養瓶中，24 h 待細胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培養基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養基，于24 h收集各組細胞，RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。蛋白上樣后進行電泳分離蛋白，結束后轉移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，孵育一抗和二抗，化學發光顯影及定影后，拍照。Western blotting 結束后，使用SensiAnsys 分析各蛋白條帶的灰度值。

1.2.7 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測將大鼠SMSCs P4 接種于培養瓶中，24 h 待細胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培養基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養基，于24 h 收集各組上清液200 μL，離心后分裝，按照試劑盒說明書要求，檢測上清液中透明質酸（hyaluronic acid，HA）的含量，使用酶標儀得到各處理組OD值。

1.3 統計學方法所有統計均使用SPSS 23.0 軟件進行分析。實驗數據采用均數±標準差表示，CCK-8、PCR 及Western blot 結果采用單因素方差分析比較對照組和高糖組之間的差異，ELISA 結果進行配對T檢驗。P＜0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖促進大鼠SMCSs 增殖CCK-8 結果顯示，在24 h，兩組的SMCSs 增殖活性之間的差異無統計學意義（P=0.675），提示在本實驗條件下，24 h 時間點，高糖環境不影響SMCSs 的增殖活性（圖1）。

圖1 細胞增殖活性Fig.1 Cell proliferative activity

2.2 高糖增加大鼠SMSCs β-半乳糖苷酶表達衰老相關β-半乳糖苷酶是應用最廣泛的細胞衰老標志物，利用β-半乳糖苷酶染色檢測高糖對SMCSs β-半乳糖苷酶陽性細胞的影響。結果顯示，培養24 h，與對照組相比，高糖導致SMCSs β-半乳糖苷酶陽性細胞增多，表明高糖促進SMCSs 細胞衰老。見圖2。

圖2 β-半乳糖苷酶染色（倒置顯微鏡，×100）Fig.2 The SA-β-Gal staining（inverted microscope，×100）

2.3 高糖增加大鼠SMSCs SASP 衰老相關因子表達qRT-PCR 結果顯示，培養24 h 后，高糖組衰老相關因子SASP 的mRNA 表達較對照組增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。統計學結果為MMP13（P=0.011），TNF、IL-6、INFβ（P=0.000），CXCL1（P=0.003）。如圖所示，高糖組MMP13、TNF、IL-6、CXCL1、INFβ 的mRNA 表達均較對照組高，提示高糖促進SMCSs 進入衰老狀態。見圖3。

圖3 MMP13、TNF、IL-6、CXCL1、INF-β mRNA 相對表達量Fig.3 The mRNA expression of MMP13，TNF，IL-6，CXCL1 and INF-β

2.4 高糖促進大鼠SMSCs 線粒體裂解培養24 h后，行Mito-tracter 染色，40 倍顯微鏡下觀察，高糖組較對照組細胞中線粒體碎片化顯著增加（圖4），高糖促進了大鼠SMSCs 線粒體的裂解。

圖4 Mito-tracter 染色（激光共聚焦顯微鏡，×40）Fig.4 Mito-tracter staining（laser scanning confocal microscope，×40）

2.5 高糖抑制大鼠SMSCs p21蛋白表達Western blotting 結果顯示，培養24 h 后，高糖組衰老相關蛋白p21 表達下降，方差分析顯示與對照組相比差異有統計學意義（P=0.00），表明高糖培養條件抑制了大鼠滑膜間充質干細胞的p21 蛋白表達（圖5）。

圖5 p21 蛋白表達量Fig.5 The protein expression of p21

2.6 高糖抑制大鼠SMSCs 透明質酸分泌ELISA結果培養24 h 后，與對照組相比，高糖組透明質酸分泌被明顯抑制，采用配對t檢驗進行數據統計，結果顯示差異有統計學意義（P=0.002），表明高糖培養條件抑制了大鼠滑膜間充質干細胞的透明質酸分泌。見圖6。

圖6 透明質酸濃度Fig.6 The concentration of HA

3 討論

本實驗結果顯示，高糖刺激下，大鼠SMSCs SAβ-gal 染色陽性細胞增加，胞內線粒體呈碎片化，衰老相關分泌表型SASP 表達增加，p21 表達及透明質酸分泌降低。以上結果表明，高糖導致大鼠SMSCs 進入衰老狀態，破壞了細胞的生物學功能，將進一步影響體內微環境，導致糖尿病OA 患者的預后和轉歸產生不確定性。

SMSCs 本身的增殖功能下降和衰老，將導致其自我更新潛能弱化。研究表明，高糖可以促進多種細胞的增殖，對于干細胞而言，則未必。高糖（25 mmol/L）可以促進端粒酶永生化的間充質干細胞的增殖，其凋亡不受高糖環境影響，而對髓核來源的間充質干細胞，25 mmol/L 的高糖培養3 d 并不會影響其增殖和遷移能力，而在對數生長期，干細胞增殖受到高糖抑制［12］。本研究中CCK-8 結果顯示高糖條件下本應受到促進的增殖并未發生，表明高糖使SMSCs 本身的增殖功能下降。β-半乳糖苷酶的活性升高是鑒定細胞衰老的金標準［13］，高糖組SMSCs 的SA-β-gal 陽性細胞多于對照組，提示衰老SMSCs 可能在高血糖狀態下增加或積累。此時衰老SMSCs 的增加或積累，并非一過性，p21（全稱p21Waf/Cip1）是一個重要的細胞周期阻滯因子，其主要功能是阻滯細胞周期在G1/S 期，當p21 功能缺失時，就可能使損傷的細胞強行進入細胞周期，走向衰老和凋亡［14］。本研究中，高糖刺激下SMCSs 的p21 表達下調，表明此時細胞受到損傷，且因p21 表達下調而無法修復損傷，加速細胞進入衰老狀態。SMSCs 作為治療OA 的潛力細胞，其自我更新能力尤為重要，而SMSCs 增殖功能下降和衰老，將導致該潛能弱化。

線粒體與干細胞特性的維持和干細胞分化成特定的細胞類型有關，線粒體的動力學（融合和裂變）失衡將導致干細胞衰老并影響干細胞的功能。本實驗中，Mito-tracter 染色，高糖組細胞線粒體碎片化明顯增加。線粒體裂變的增加，可以擴大與氧氣的接觸面積，實現更多的產能，但是也會增加酸的產生，增加產熱，不利于細胞生長，影響細胞功能［15］。當線粒體損傷或未折疊蛋白在線粒體中積累時，線粒體裂變增加，以稀釋或分離受損蛋白，以便進一步降解，同時，通過線粒體自噬清除線粒體可能有助于處理受損的蛋白質。高糖條件下，線粒體的裂變增加，可能是線粒體自噬功能受損導致，具體機制仍需進一步探討。

SASP 是干細胞衰老相關的重要標志，包括各種細胞因子、趨化因子、細胞外基質蛋白和生長因子，SASP 的表達上調，從多層面影響了SMSCs 的生物學功能，抑制了SMSCs 的成軟骨分化，并加重炎癥，破壞軟骨基質。IL-6 被認為是與OA 相關的重要炎癥因子，在OA 患者的滑膜液中IL-6 表達上調，與MMPs 呈正相關［16］。此外，研究發現IL-6 阻礙了滑膜液中的MSCs 向軟骨分化，從而降低了干細胞為基礎的顳下頜關節性骨關節炎治療的有效性［17］。干擾素（IFN）作為一種細胞因子亞群，可調節骨基質的動態平衡，與MMPs 的表達相關。MMP13 在骨關節炎中的上調，導致軟骨關鍵結構蛋白Ⅱ型膠原降解、基質破壞和炎癥，已有研究發現MMP13 沉默減少了關節軟骨退化/纖顫、半月板惡化、滑膜增生、骨贅和促炎基因表達［18］。TNF-α可誘導IL-6 的產生［19］。趨化因子在糖尿病性骨關節炎的發生發展中發揮重要作用，在部分由趨化因子驅動的進行性滑膜炎中，滑膜分泌大量代謝廢物，進而進一步加重炎癥［20］。在本研究中，高糖環境下，TNF-α、IL-6、CXCL1 表達均上調，提示高糖可能通過激活NF-κB 信號通路導致細胞衰老及功能受損，而SASP 表達上調涉及多條信號通路，提示該病程并非單一通路激活的結果，具體機制需進一步研究。

透明質酸來源于滑膜細胞及滑膜間充質干細胞，在滑膜液的減震、潤滑和粘彈性方面起著重要作用。當骨性關節炎發生時，透明質酸HA 解聚，相對于正常情況，分子量降低，清除更快，導致滑膜液粘彈性受損［21］。研究發現，在骨性關節炎患者的關節腔內注射透明質酸，能有效減弱炎癥反應，誘導細胞的軟骨向分化［22］。因此，高糖環境下，SMCSs 分泌HA 減少，并由于SMCSs 的衰老，導致滑膜細胞生成減少，進一步間接降低了HA 的分泌，不利于OA 的治療。

以上結果表明，將SMSCs 應用于糖尿病OA 患者治療，將存在以下風險：高糖導致SMSCs 進入衰老狀態，其增殖功能受損，將導致自我更新潛能弱化，同時，SMSCs 衰老及生物學功能的破壞，使SMSCs 的成軟骨分化能力及關節修復能力下降，導致糖尿病OA 患者的預后和轉歸產生不確定性。