紅景天苷改善慢性阻塞性肺疾病炎癥模型及氣道重塑的機制

黃鶯 周芬 袁文勝 徐芳

1武漢市第一醫院呼吸與危重癥醫學科（武漢 430022）；2泰康同濟（武漢）醫院呼吸與危重癥醫學科（武漢 430022）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以氣道炎癥和氣道重塑為主要病理特征的呼吸系統疾病，以抗炎、逆轉氣道重塑為主要治療目標。紅景天苷（Salidroside，SAL）為紅景天主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗惡病質、抗凋亡等特性［1］，LUO 等［2］報道紅景天苷可通過抗炎作用緩解香煙煙霧引起的小鼠COPD 病情，但關于其在COPD 中的作用機制尚無定論。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）為核受體超家族成員之一，在肺部炎癥控制中扮演了重要角色［3］。轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）為促纖維化細胞因子，在氣道炎癥與氣道重塑中發揮了重要作用。研究表明，TGF-β1/果蠅母源抗生物皮膚生長因子（drosophilamothersagainstdecapentaplegic，Smad）通路是TGF-β1 誘導氣道重塑的重要途徑之一，其中Smad 蛋白是該途徑調節系統的細胞內效應子，可介導細胞內信號傳導，并促進靶基因轉錄［4］。為故本實驗擬分析紅景天苷治療COPD 的功效，探索其通過PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路影響COPD 相關炎癥與重塑的潛在機制，為研發COPD治療新藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF 級雄性SD 大鼠，40 只，7 周齡，體質量260～270 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證號SCXK（京）2019-0010。實驗開展前適應性飼養1 周，動物房溫度22～26 ℃，相對濕度40%～60%，自然光照，普通飼料喂養，自由攝食飲水。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器紅旗渠香煙（焦油13 mg，尼古丁1.1 mg，河南安陽卷煙廠），布地奈德混懸液（AstraZeneca Pty Ltd，注冊證號H20140475，規格2 mL：1 mg），紅景天苷（北京索萊寶科技有限公司，HPLC ≥98%，分子式C14H20O7，分子量300.3，貨號SS8080）。大鼠白介素-8（interleukin-8，IL-8）、IL-10 ELISA 試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司），PPAR-γ、磷酸化PPAR-γ（p-PPAR-γ）、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3 和GAPDH 一抗（Abcam），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（上海碧云天生物科技有限公司）。Buxcodx 動物肺功能分析系統PFT（美國BUXCO 公司），Smart view 凝膠圖像分析系統（美國Major Science 公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組和干預將大鼠隨機分為正常組、模型組、SAL 低劑量組、SAL 高劑量組和陽性對照組，每組8 只。除了正常組不作任何處理，其余四組用香煙煙熏法建立大鼠COPD 模型［5］：自制45 cm × 55 cm × 60 cm 煙熏箱，將大鼠置入箱內，每次點燃6 支香煙，每次煙熏10 min 左右，香煙燃盡5 min 后，打開頂蓋讓大鼠休息5 min，然后再次點燃6 支香煙重復上述步驟。每日煙熏1 次，每周6 次，共計36 周。連續煙熏7 d 后，第8 天開始煙熏前半小時予以腹腔注射給藥，直至第36周最后1次煙熏結束。SAL 低、高劑量組每日上午煙熏前半小時分別腹腔注射紅景天苷100、200 mg/kg［6］，模型組和正常組腹腔注射等體積生理鹽水，陽性對照組予以霧化吸入布地奈德0.025 mg/kg，每日2次，該劑量參考《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》，動物與人每公斤體重劑量折算系數6.25，折算大鼠用藥劑量為此劑量［7］。觀察大鼠一般狀況。

1.2.2 小動物肺功能檢測儀檢測各組大鼠肺功能最后1 次用藥結束后，在大鼠器官軟骨環之間取水平切口，置入金屬插管固定，將大鼠置入體描箱，鏈接數據分析系統，檢測呼吸功能參數用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、第0.1 秒最大用力呼氣容量（FEV0.1）、呼氣峰流速（Peak Expiratory Flow，PEF），重復3 次檢測，計算FEV0.1/FVC和PEF 值。

1.2.3 ELISA 法測定大鼠血清炎癥因子腹主動脈采血，離心取血清，參考大鼠血清IL-8、IL-10 ELISA 試劑盒檢測。

1.2.4 HE 染色觀察大鼠肺組織病理變化處死大鼠，取右肺中葉，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后制作3 μm 厚左右的連續切片。取一半切片根據HE 染色試劑盒染色，脫水，透明，封片，鏡下計數炎性細胞，隨機選取10 個視野計數，用半定量法進行評分：（1）無肺泡炎（-）；（2）輕度肺泡炎（+），細胞浸潤致肺泡隔增寬，病變范圍不足全肺20%；（3）中度肺泡炎（++），病變范圍占全肺20%～50%；（4）重度肺泡炎（+++），病變彌漫性分布，范圍超過50%。根據分級依次計1、2、3、4 分。

1.2.5 Masson染色觀察氣道平滑肌與膠原面積取剩余切片脫蠟至水，置入Masson復合染色液10 min，清洗，置入5%磷鎢酸1 min，清洗，置入亮綠染色液，脫水、透明、封片。用Img-Pro 6.0 圖像分析系統，確定5 個完整的支氣管橫截面，測定支氣管基底膜內壁周徑（Pbm）、膠原沉積面積（Wcol）和平滑肌面積（WAm）。

1.2.6 Western blot 檢測肺組織中PPAR-γ/TGFβ1/Smad2/3 通路蛋白表達取左肺組織研磨，裂解后提取蛋白液，BCA 法進行蛋白質定量，電泳后轉膜、封閉。與兔抗大鼠PPAR-γ、p-PPAR-γ、TGFβ1、Smad2/3、p-Smad2/3 和GAPDH 一抗（1∶1 000）孵育過夜后，加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。經發光、顯影和定影后，分析目的蛋白與內參蛋白灰度值比值。

1.3 統計學方法采用SPSS 26.0 統計軟件分析本次實驗數據，計量資料以均數±標準差表示，多組進行單因素方差分析，進一步兩兩比較進行LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況造模開始后，大鼠有明顯的氣促、煩躁和站立不穩等癥狀，且隨著造模時間延長，上述表現越來越明顯，同時出現反應遲鈍、毛色晦暗以及體重減輕等情況，表示造模成功。與模型組比較，干預組用藥后上述表現有所好轉，且有時間依賴性。正常組大鼠外觀、活動、精神以及呼吸等均正常。

2.2 大鼠肺功能指標與正常組比較，模型組大鼠FEV0.1/FVC 和PEF 值降低（P＜0.05）；與模型組比較，SAL 低、高劑量組和陽性對照組大鼠FEV0.1/FVC 和PEF 值升高，其中SAL 低劑量組＜SAL 高劑量組＜陽性對照組（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠肺功能指標Tab.1 Pulmonary function indexes of rats in each group x±s

2.3 大鼠血清炎癥因子與正常組比較，模型組大鼠血清IL-8 水平較高，IL-10 水平較低（P＜0.05）；與模型組比較，SAL 低、高劑量組和陽性對照組大鼠血清IL-8 水平較低，IL-10 水平較高（P＜0.05）；與SAL 低劑量組比較，SAL 高劑量組和陽性對照組大鼠血清IL-8 水平較低，IL-10 水平較高（P＜0.05）；與SAL 高劑量組比較，陽性對照組大鼠血清IL-8 水平較低，IL-10 水平較高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子Tab.2 Serum inflammatory factors of rats in each group x±s，pg/mL

2.4 大鼠肺組織病理改變HE 染色（圖1）顯示：與正常組比較，模型組支氣管壁、間隔和血管周圍有大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，SAL 低劑量組有所改善，SAL 高劑量組進一步改善，陽性對照組顯著改善。肺泡炎癥半定量評分：對照組＜陽性對照組＜SAL 高劑量組＜SAL 低劑量組＜模型組（P＜0.05），見表3。

圖1 肺組織病理學（HE 染色，×200，標尺50 μm）Fig.1 Lung histopathology（HE staining，×200，scale bar 50 μm）

表3 大鼠肺泡炎癥程度半定量評分Tab.3 Semi-quantitative score of the degree of alveolar inflammation in rats ±s，分

表3 大鼠肺泡炎癥程度半定量評分Tab.3 Semi-quantitative score of the degree of alveolar inflammation in rats ±s，分

組別正常組模型組SAL 低劑量組SAL 高劑量組陽性對照組例數8 8 8 8 8肺泡炎癥評分0.12±0.02 3.66±0.18*2.96±0.14*#1.72±0.12*#&0.78±0.08*#&△

2.5 大鼠氣道病理改變Masson 染色（圖2）顯示：支氣管壁平滑肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色，與正常組比較，模型組大鼠平滑肌明顯增生、肥大，氣道膠原沉積明顯增多。與模型組比較，SAL 低劑量組氣道上述病理表現減輕，AL 高劑量組進一步減輕，陽性對照組顯著減輕。大鼠氣道WAm/Pbm、Wcol/Pbm 值：對照組＜陽性對照組＜SAL高劑量組＜SAL低劑量組＜模型組（P＜0.05），見表4。

表4 大鼠氣道病理表現Tab.4 Pathological manifestations of rat airway x±s，μm2/μm

圖2 大鼠肺部病理圖（Masson 染色，×200，標尺100 μm）Fig.2 Pathological map of rat lungs（Masson staining，×200，scale bar 100 μm）

2.6 大鼠肺組織中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路蛋白表達各組PPAR-γ 和Smad2/3 蛋白表達比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組大鼠肺組織中p-PPAR-γ 蛋白表達水平較高，TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表達水平較低（P＜0.05）；與模型組比較，SAL 低、高劑量組大鼠肺組織中p-PPAR-γ 蛋白表達水平較低，TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表達水平較高（P＜0.05）；與SAL 低劑量組比較，SAL 高劑量組大鼠肺組織中p-PPAR-γ 蛋白表達水平較低，TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表達水平較高（P＜0.05），見表5、圖3-4。

圖3 大鼠肺組織中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 通路蛋白條帶圖Fig.3 PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 pathway protein bands in rat lung tissue

表5 大鼠肺組織中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路蛋白表達Tab.5 PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 pathway protein expression in rat lung tissue ±s

表5 大鼠肺組織中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路蛋白表達Tab.5 PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 pathway protein expression in rat lung tissue ±s

組別正常組模型組SAL 低劑量組SAL 高劑量組p-PPAR-γ 0.25±0.03 0.97±0.06*0.69±0.05*#0.41±0.03*#&PPAR-γ 0.98±0.07 0.99±0.06 0.98±0.08 0.97±0.09 TGF-β1 0.46±0.04 0.09±0.01*0.22±0.02*#0.34±0.03*#&p-Smad2/3 0.75±0.06 0.22±0.03*0.43±0.04*#0.60±0.05*#&Smad2/3 0.95±0.06 0.94±0.07 0.93±0.08 0.96±0.08

3 討論

COPD 的發生機制尚未明確，西醫常用布地奈德等吸入糖皮質激素治療，但部分患者對其敏感性降低，甚至出現抵抗。中醫藥在COPD 治療中有著眾多方法和獨特優勢，其中紅景天性寒、味甘而澀，歸肺經，有補肺氣、散瘀活血之功效，常用于COPD 治療中。紅景天苷是從紅景天中提取的一種化合物，有許多有益的病理功效，HU 等［8］報道紅景天苷有抗炎功效，ZHANG 等［9］證明紅景天苷可治療肺損傷，故將其作為實驗藥物，并嘗試分析其作用機制。

圖4 大鼠肺組織中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 通路蛋白表達水平Fig.4 Expression levels of PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 pathway proteins in rat lung tissue

COPD 是以氣流受限為特征，伴發肺對有毒氣體或顆粒異常炎癥反應的呼吸病，其發生與吸煙密不可分。故本實驗以香煙煙熏造模，發現大鼠出現呼吸急促、口唇發紺等COPD 癥狀，且病理切片可見肺組織出現炎性細胞浸潤，平滑肌增厚，氣道膠原沉積，符合COPD 與氣道重塑的病理變化，說明造模成功。FEV0.1/FVC 和PEF 是臨床評估肺功能的常用指標，其中FEV0.1/FVC 反應個體通氣功能，PEF 則可判斷氣道是否堵塞，本研究結果顯示：紅景天苷干預后大鼠FEV0.1/FVC 和PEF 值升高，提示紅景天苷可改善COPD 大鼠肺功能。氣道炎癥和氣道重塑幾乎同步，HE 染色觀察發現，與模型組比較，SAL 低、高劑量組大鼠肺組織炎癥浸潤明顯減輕，炎癥評分降低，提示紅景天苷對COPD有抗炎功效。IL-8 為介導肺部炎癥反應的重要介質，是T 淋巴細胞和中性粒細胞強趨化因子，能夠募集大量T 淋巴細胞與中性粒細胞持續聚集在肺部。煙熏可刺激中性粒細胞、巨噬細胞等分泌大量IL-8，誘導上述炎癥細胞聚集在肺部，形成惡性循環［10］。IL-8 還可促進中性粒細胞釋放彈性蛋白酶，破壞彈性纖維，刺激尿液分泌，增加基底膜，引起支氣管痙攣，刺激內皮細胞分泌IL-8，最終形成鏈式反應，加重肺部炎癥反應。IL-10 是活化的T 細胞與單核細胞所分泌，可抑制內皮細胞和單核細胞等分泌促炎因子，比如縮短煙熏誘發的肺內炎癥細胞增加過程，抑制促炎因子腫瘤壞死因子α、IL-6 等表達，減輕肺部炎癥反應，是肺部炎癥一個重要內源性抑制劑［11］。本研究顯示：紅景天苷干預后大鼠血清IL-8 水平較低、IL-10 較高，肺組織浸潤減少，肺泡炎癥評分較低，提示紅景天苷可抑制IL-8 分泌同時提升IL-10 濃度，紅景天苷對COPD 有抑炎作用。Masson 染色顯示：紅景天苷干預后大鼠平滑肌增生和氣道膠原沉積均明顯減少，WAm/Pbm 和Wcol/Pbm 值降低，提示紅景天苷可對COPD 大鼠氣道重塑有改善作用，這對減輕COPD氣促等癥狀及抑制COPD進展有重大作用。

PPARs 是核激素受體超家族成員，也是依賴配體活化的一類轉錄因子，可通過反式阻抑機制抑制細胞促炎作用，PPAR-γ作為其亞型之一，本身及其配體因抗炎作用顯著而備受關注［12-13］。TAM 等［14］通過建立體外肺泡巨噬細胞模型和與COPD相關的體內動物模型，發現了PPAR-γ的抗炎潛力，證明其相關激動劑對煙草引起的肺部炎癥有治療作用。本研究中，紅景天苷干預后大鼠肺組織中p-PPAR-γ蛋白表達水平升高，提示紅景天苷可上調COPD 大鼠肺部PPAR-γ 蛋白表達，這可能是紅景天苷發揮抗炎作用的靶蛋白。TGF-β超家族在細胞外基質重塑方面有重要作用，其中TGF-β1 是一種重要的促纖維化因子和炎癥介質，可促進膠原蛋白聚集在細胞外基質內，導致氣道重塑［15-16］。Smads 蛋白家族是迄今唯一被證明的TGF-β受體作用底物，也是TGF-β1受體復合物下游信號調節蛋白，其中Smad3為受體調節型Smad 蛋白，與Smad2 一起被TGF-β1Ⅳ型受體激活后，與Smad4組成異源性多聚體，轉入細胞核，激活DNA 轉錄，調節靶蛋白表達。DENG等［17］、SUN 等［18］證明Smad2 過表達時會增加氣道膠原蛋白沉積，促進平滑肌增生，導致氣道平滑肌增厚，推測Smad2與氣道重塑有關。本實驗中，模型組肺部TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達水平高于正常組，提示煙熏造模激活了TGF-β1/Smad 信號通路；紅景天苷干預后大鼠肺部TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表達水平降低，提示紅景天苷可抑制TGF-β1/Smad 信號通路，這可能是其抑制肺纖維化、肺部炎癥以及氣道重塑的機制之一。

總之，紅景天苷對COPD 大鼠有抗炎和改善氣道重塑的作用，可能通過調節PPAR-γ/TGF-β1/Smad信號通路實現的。但本研究亦存在一些不足，比如紅景天苷是否能靶向PPAR-γ、PPAR-γ 是否為紅景天苷唯一靶點等，這將在未來進一步研究。