線粒體ND4基因12026 A→G突變與糖尿病視網膜病變視網膜中央動脈血流動力學變化的關系

王思琦 盧雪 金香子 于婕 金光明

延邊大學附屬醫院超聲醫學科（吉林延吉 133000）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）和糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）最常見的微血管并發癥［1-2］。現階段，從基因水平研究病因及預測風險因素是各國研究的熱點，至今已有20 多種線粒體基因突變被發現與T2DM 有關［3-5］。有學者認為［6］同一疾病在不同民族之間，其易感基因也存在差異，朝鮮族作為我國代表性少數民族之一，研究其T2DM 及DR 的易感基因是非常有意義的。另據研究表明［7］，由炎癥介質、神經遞質引發的炎癥及應激反應，可引起DR 患者視網膜中央動脈（central retinal artery，CRA）的血流動力學改變，這是導致DR 發生發展的重要原因。彩色多普勒超聲（colour doppler ultrasound，CDUS）是臨床上應用最為廣泛的檢查技術，在檢測血流動力學指標方面，具有其他檢查無可比擬的優勢。本研究創新性地將基因突變與血流動力學改變相結合，旨在為延邊朝鮮族T2DM 患者早期診斷DR 提供一些預警信息，以達到早期預防DR 發生的目標。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年1月至2021年8月在我院內分泌科及眼科住院的朝鮮族T2DM 患者198 例，其中男103 例，女95 例，平均年齡（53.87 ±15.30）歲。依據2014年中華醫學會眼科學分會眼底病學組撰寫的《我國糖尿病視網膜病變臨床診療指南（2014年）》進行眼底病變分期。所有T2DM患者行眼底鏡、裂隙燈檢查并眼底照相。診斷出DR 患者67 例，無DR 患者131 例。應用PCR-RFLP技術檢測患者線粒體ND4 基因12026 A→G 突變，根據結果分為無基因突變組和存在基因突變組，再以CDUS 對患者眼部進行檢查，記錄CRA 血流動力學指標。本研究倫理審核批準號為IACUC-201910010-81，實驗前向所有患者詳細告知實驗內容，在患者自愿條件下簽署知情同意書。

1.2 CRA 血流動力學檢查方法應用SIEMENS S2000 彩色多普勒超聲診斷儀，選用線陣探頭（頻率5～10 MHz），進行操作時，所有患者彩超診斷儀設定條件均一致。囑患者取仰臥位，閉合眼瞼，探頭置于眼瞼上方，當二維圖像上出現眼球及視神經后，加用彩色多普勒超聲，當清晰顯示CRA 主干血流束時，將其放置于彩色取樣框中央，再緩慢將取樣線中心移至血流束顏色最明亮處，進行頻譜多普勒測量，根據測量結果分別記錄每位患者CRA 搏動指數（PI）、阻力指數（RI）最高流速（Vmax）、最低流速（Vmin）、平均流速（Vmean）和血流速度積分（VTI）等血流動力學參數。

1.3 DNA 提取和基因型檢測

1.3.1 基因組DNA 提取空腹條件下，抽取患者靜脈血3 mL，從中提取300 μL 移至1.5 mL 離心管中，按照DNA 基因組純化試劑盒（賽默飛世爾科技）說明書上的步驟提取DNA，經紫外分光光度計定量，最后置于超低溫冰箱儲存。

1.3.2 聚合酶鏈反應根據基因庫數據，上游引物：5′-TTTACCACAACACAATGGGG-3′，下游引物：5′-AAGGGGTCGTAAGCCTCTGT-3′，由賽默飛世爾科技公司合成。在離心管中依次加入5 μL 的10×PCR 緩沖液，5 μL 的dNTP（濃度為2.5 mmol/L），5 μL 的模板DNA，0.5 μL 的Taq DNA 聚合酶及上、下游引物各1 μL，其余部分添加無菌蒸餾水直至PCR 擴增反應體系達到50 μL。以賽默飛世爾熱循環PCR 儀（Veriti 96）進行擴增，具體條件為：95 ℃預變性5 min；再按如下程序循環35 次：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；末次循環后，72 ℃延伸10 min。

1.3.3 限制性酶切離心管中分別加入PCR 擴增產物10 μL，0.5 μL Hinc Ⅱ內切酶（賽默飛世爾科技公司）進行酶切反應，結束后置于37 ℃水浴箱中孵育3 h。5%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色后經紫外燈判斷結果并拍照，判定所有樣本基因型。

1.4 統計學方法用SPSS 23.0 軟件包進行分析。計數資料以例數和百分數表示，比較用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗或方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 線粒體基因ND4 12026（A→G）突變反向測序結果基因測序委托中科生信（北京信源佳生物科技有限公司）進行，實驗根據“H-W 平衡定律”檢驗線粒體基因，結果顯示基因型分布符合遺傳平衡定律。進一步進行反向測序，結果顯示線粒體基因12026 位點存在A→G 突變（圖1）。

圖1 線粒體基因ND4 12026（A→G）突變反向測序圖Fig.1 Reverse sequencing of mitochondrial gene ND4 12026（A→G）mutation

2.2 線粒體基因ND4（12026）基因型判定經PCR 擴增后，線粒體ND4（12026）基因所得產物長度為209 bp，限制性內切酶HincⅡ酶切識別位點為GTY↓RAC（R=A 或G，Y=G 或T），線粒體DNA 12026 位點發生突變時將其分割成171 bp 和38 bp 兩個片段（圖2）。

圖2 HincⅡ酶切線粒體基因ND4（12026）5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 5%agarose gel electrophoresis of Hinc Ⅱenzyme digestion of mitochondrial gene ND4（12026）

2.3 無DR與DR患者線粒體ND4基因12026A→G突變情況在無DR 組131 例T2DM 患者中，檢出線粒體DNA 12026 A→G 突變1 例，其突變率為0.08%；在DR 組67 例T2DM 患者中，檢出線粒體DNA 12026 A→G突變10例，其突變率為14.91%，差異有統計學意義（χ2=3.522，P=0.023）。見表1。

2.4 無基因突變和有基因突變DR 患者CRA 血流動力學的比較有基因突變的DR 患者的CRA血流速度Vmax、Vmin、Vmean 及VTI 較無基因突變的DR 患者降低（P＜0.05），而PI、RI 增加（P＜0.001）。見表1、圖3。

表1 無基因突變和有基因突變DR 患者之間CRA 血流動力學比較Tab.1 Comparison of CRA hemodynamics between DR patients without and with gene mutation ±s

表1 無基因突變和有基因突變DR 患者之間CRA 血流動力學比較Tab.1 Comparison of CRA hemodynamics between DR patients without and with gene mutation ±s

組別無突變組存在突變組P 值例數57 10 Vmax（cm/s）15.29±3.70 7.81±0.27 0.041 Vmin（cm/s）5.37±1.36 2.02±0.48 0.039 Vmean（cm/s）10.30±11.59 4.56±1.44 0.044 VTI 8.86±2.60 4.03±1.15 0.036 PI 0.51±0.52 0.87±0.24＜0.001 RI 0.53±0.03 0.82±0.18＜0.001

圖3 無突變和存在突變的DR 患者CRA 血流動力學超聲圖Fig.3 Ultrasonography of CRA hemodynamics in DR patients without and with mutations

3 討論

本研究中首先應用PCR-RFLP 技術和直接測序法檢測了延邊地區198 例朝鮮族T2DM 患者線粒體ND4 基因12026 A→G 突變的情況，根據結果將其分為無基因突變和有基因突變兩組，再應用CDUS 對兩組患者的CRA 血流動力學進行監測。發現DR患者突變率為14.9%，無DR患者突變率為0.08%，差異有統計學意義。

CRA 是負責滋養視網膜、維持視網膜血運的最主要動脈血管，一旦CRA 發生血管硬化、管腔狹窄、甚至閉塞時，則會導致視網膜毛細血管缺血缺氧，引發視網膜病變，甚至導致失明。研究顯示，線粒體DNA 中的某些基因突變可以導致機體葡萄糖、胰島素、脂質水平代謝異常，從而引起T2DM患者血管并發癥的發生和發展［8-9］。此外，線粒體ND4 基因12026 A→G 的突變可導致T2DM 患者產生過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 引發CRA 硬化并最終形成DR 的可能機制如下：（1）使低密度脂蛋白被氧化，導致大量氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein cholesterol，ox-LDL）的形成，當其被巨噬細胞吞噬后，形成泡沫細胞堆積于血管壁，引發血管壁彈性下降［10］。（2）引發高級糖基化末端產物（advanced glycosylation end，AGE）的大量形成，通過激活多元醇、己糖胺和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等信號通路，使環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在血管內皮過度表達，導致血管平滑肌的增殖遷移及血管內皮的缺血［11-13］。（3）與一氧化氮（nitric oxide，NO）協同作用產生大量過氧亞硝基陰離子（peroxynitroso anion，ONOO-），通過硝基化作用，導致血管壁纖維組織增生及鈣質沉著，甚至斑塊形成發生狹窄［14］。上述結果均會導致存在該基因突變的T2DM 患者CRA血管內阻力增大及血管彈性降低，因此在CDUS 檢測時，呈現出CRA 血流速度明顯降低，RI、PI 值升高的情況。

有不同學者［15-18］分別對我國云南、南昌和上海等地區漢族T2DM 患者線粒體基因mt12026 A→G 突變進行了研究，得出了該基因突變與漢族T2DM 患者的發病相關的結論，并且認為存在此基因突變的T2DM 患者起病更早，擁有明確的遺傳史，在治療上應盡早使用胰島素治療。而國內其他少數民族有關此類的研究則較稀少，根據本研究可得出初步結論，線粒體基因mt12026 A→G 突變是漢族與朝鮮族T2DM 患者發展為DR 的共同易感基因，這與一些國外學者的研究結果相類似［19-21］，但此基因突變是否是不同人種的普遍易感基因則需要結合不同人種做進一步的研究方可確定。

綜上所述，存在線粒體ND4 基因12026A→G 突變的T2DM 患者，提示其發展為DR 的可能性升高，或可作為臨床的一項預警信息。通過CDUS 觀察評價T2DM 患者CRA 血流動力學變化，可作為預警DR的一項參考信息，具有一定的實用價值。