基于生物信息學分析早期糖尿病腎病發病機制

李英娜 董蘭 劉婉珊 全林菲 何鳳

廣州市第一人民醫院腎內科（廣州 510180）

糖尿病（diabetic mellitus，DM）是一種累及全身多個器官、具有高致殘率和致死率，嚴重危害公眾健康的慢性代謝性疾病。我國已是糖尿病第一大國，而糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的慢性微血管并發癥之一，是目前全球終末期腎臟病（ESRD）的主要原因之一，目前已成為我國需迫切解決的慢性疾病問題之一［1-3］。然而，目前的臨床治療措施有限，不能有效阻止糖尿病腎病向ESRD 進展。ESRD 患者大多需終身替代治療，高昂的費用與無明顯改善的預后，使之成為我國醫療系統、患者及其家屬的巨大負擔。糖尿病腎病的發病機制極為復雜，目前較多研究表明其病程的發生發展主要與血流動力學異常和糖脂代謝紊亂等過程有關，但其具體機制仍待進一步闡明［4］。越來越多的流行病學和臨床前研究表明［5］，炎癥反應在糖尿病腎病的發病機制上占有重要的地位，其可能是發病初期最先參與的過程，然而其具體的發病機制尚未完全闡明。因此，以炎癥為靶標去探尋糖尿病腎病診斷和治療的新視野是目前研究的一大熱點，同時對糖尿病腎病早期潛在的致病分子和治療靶點亦是亟待挖掘。

基因表達綜合庫（gene expression omnibus，GEO）創建于2000年，是由美國國立生物技術信息中心（NCBI）創建并維護的基因表達數據庫，是目前最大的公共基因資源庫，其中海納了高通量基因表達數據，具有全面的生物學資料且獲取方式簡單易操作。測序技術為生物科學研究帶來了新思路，隨著生物信息學的提出及發展，生物信息學工具收集、儲存、整合、分析這些海量的數據，為探尋更加深刻的分子機制提供可能性，更有利于深入探索疾病進展中的分子變化和相關信號通路的功能聯系。本研究擬利用生物信息學方法，分析并挖掘早期糖尿病腎病發生和發展的重要信號通路及分子，為進一步闡明糖尿病腎病的發病機制以及靶向分子治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 標本來源收集2019年1月至2021年1月收治于廣州市第一人民醫院腎內科首次入院并經腎臟組織病理活檢確診的DN 患者6 例（eDN 組），診斷符合糖尿病腎臟疾病臨床診療中國指南（2021版）［6］。對照組（NC 組，6 例）樣本為腫瘤切除術后癌旁正常組織。本項研究經廣州市第一人民醫院倫理委員會批準，獲得所有參與者/患者的知情同意書。手術獲取標本組織后立即放置于凍存管中，隨后轉入液氮，最后放于-80 ℃冰箱儲存備用。

1.2 儀器與試劑包括常溫/4 ℃離心機（Thermo，Eppendorf）；Nanodrop 2000 分光光度計（Thermo Scientific）；普通PCR（ABI）；實時熒光定量PCR 儀（Roche）；Trizol 提取液（Sigma）；逆轉錄試劑盒（HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit，Vazyme）；SYBR?Premix Ex TaqTM（SYBR Green，Vazyme）；焦碳酸二乙酯（DEPC，Sigma）；免疫組化試劑盒（Bioss IHC001）；石蠟切片機（Leica HistoCore MULTICUT）；載玻片；蓋玻片；中性樹脂；明場正置顯微鏡（Lecia DM2500）。

1.3 數據集獲取及差異基因的篩選在NCBI 的基因表達綜合（GEO）數據庫中下載RNA 測序譜GSE142025 數據集，應用R 語言對其進行基因表達分析。該數據集中包含NC組（6例）與eDN組（6例）的基因表達數據。基于R 軟件中“limma”包可視化NC 組與eDN 組之間的差異表達基因（DEGs），以P＜0.05 和|log2FC|＞1 為DEGs 的篩選標準。使用R 版本4.0.3 對GEO 數據集進行分析。

1.4 生物信息學分析使用R 語言中“pheatmap”“ggplot2”“tidyverse”等軟件包，通過heatmap 和volcano 將DEGs 中顯著的差異基因展示出來。

采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）方法，利用R 軟件分析差異表達基因數據，獲取eDN 組差異表達基因富集的生物學功能與相關信號通路，設定篩選標準為：歸一化富集得分（normalized enrichment score，NES）絕對值＞1、P＜0.05、錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.25。

利用在線工具STRING（https：//cn.string-db.org/），將差異表達基因導入系統，構建PPI 網絡。采用Cytoscape3.8.0 軟件（http：//www.cytoscape.org）中的cyto Hubba 插件篩選PPI 網絡中的Hub 基因。

1.5 基因表達水平檢測

1.5.1 免疫組織化學染色（IHC）手術或穿刺所取組織于10%福爾馬林固定，進行常規組織脫水、石蠟包埋，4 μm 連續切片，切片放置37 ℃恒溫箱過夜。選擇合適的切片進行免疫組織化學染色，烤片1 h 后依次進行脫蠟、水化，使用3%H2O2抑制內源性過氧化物酶，用枸櫞酸鈉緩沖液在微波爐中進行抗原修復，5%BSA 常溫封閉1 h，棄去封閉液加入稀釋好的一抗，切片置于濕盒中放-20 ℃冰箱過夜。次日孵育二抗，后加入二氦基聯苯胺（DAB）顯色，顯微鏡下觀察效果，蘇木素復染細胞核，脫水透明后中性樹脂封片，通風處晾干于明場顯微鏡下觀察拍攝。

1.5.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）根據制造商的方案，使用Trizol 提取液（Sigma）分離提取組織標本總RNA，隨后在Nanodrop 2000 分光光度計上規范操作，檢測所提RNA 的濃度及判定其純度，并做好記錄。按試劑盒說明書操作，經逆轉錄合成為cDNA，再使用SYBR Green RT-qPCR 檢測試劑盒檢測目的基因相對表達水平，總反應體系為20 μL，每個樣品做三個復孔，以GAPDH 為內源性對照。

1.6 統計學方法使用Microsoft Excel 軟件建立資料數據表格，應用SPSS 22.0 進行統計學分析，對所有計量資料呈正態或近似正態分布的以（±s）表示，正態分布且方差齊者采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，采用兩獨立樣本的非參數秩和檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異表達基因的分析在GEO 數據庫中檢索并下載，獲取RNA 測序譜GSE142025 數據集，流程見圖1A。通過對數據進行FPKM 標準化，利用R軟件分析，發現相比較于NC組，eDN組有1 859個差異表達基因（DEGs），其中有1 063 個表達上調，有796個表達下調。其中，以P＜0.05和|log2FC|＞1為DEGs 的篩選標準。在火山圖中顯示了NC 組與eDN 組間總的差異表達基因，見圖1B。同時，用熱圖顯示了eDN 組中顯著表達上調和下調各25 個，見圖1C。

圖1 NC 組與eDN 組間的差異表達基因Fig.1 Differentially expressed genes between NCgroupand eDNgroup

2.2 KEGG 富集通路分析對篩選出1 859 個差異表達基因進行功能富集，以了解其可能參與的生物過程。使用GSEA 的方式將差異基因富集到KEGG 通路中，利用R 軟件來分析NC 組與eDN 組之間的通路富集，篩選標準為：NES 絕對值＞1、P＜0.05、FDR＜0.25，結果見表1。其中，“JAK-STAT通路”、“細胞因子受體通路”、“趨化因子信號通路”、“細胞黏附分子通路”、“細胞外基質受體相互作用通路”等顯著上調，見圖2。結果顯示，顯著上調的KEGG 富集通路多與炎癥、細胞因子、趨化因子相關，提示CCR2 等顯著上調基因可能通過炎癥相關通路參與早期糖尿病腎病的發生發展。

圖2 eDN 組中上調的KEGG 富集通路Fig.2 Up-regulated KEGG-enriched pathways in the eDN group

表1 KEGG 富集通路結果Tab.1 KEGG enrichment pathway results

2.3 蛋白質相互作用網絡的構建使用在線工具STRING 和Cytoscape 構建蛋白互作網絡（PPI），PPI中紅色為上調基因，藍色為下調基因，可見CCR2、CCR4 和CXCR3 作為HUB 基因表達顯著上調，見圖3A，提示CCR2 等HUB 基因可能通過炎癥、趨化因子信號通路發揮其作用，繼而影響早期糖尿病腎病的發生發展。

2.4 HUB基因水平的驗證通過IHC檢測HUB基因在早期糖尿病腎病患者組織中的表達，與上述生物信息學分析結果一致，相比于NC 組，CCR2、CCR4 和CXCR3 在早期糖尿病腎病患者中均顯著表達，見圖3B。同時采用RT-qPCR 對腎組織樣本進行檢測，CCR2、CCR4 和CXCR3 的相對基因表達在eDN 組較NC 組高表達，而且CCR2 mRNA 較對照組顯著上調達2.51 倍（P＜0.05），見表2與圖3C，與IHC 結果一致。

圖3 eDN 腎組織中上調HUB 基因的鑒定及檢測Fig.3 Identification and detection of up-regulated HUB genes in eDN kidney tissue

表2 NC 組與eDN 組中CCR2、CCR4、CXCR3 mRNA 水平的比較Tab.2 Comparison of CCR2，CCR4，CXCR3 mRNA levels in NC group and eDN group

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病常見的累及腎臟的慢性微血管并發癥，大約有30%～40%的糖尿病患者會最終發展為糖尿病腎病，其患病率的增加與世界范圍內糖尿病患病率的急劇上升平行，且國家收入及發展程度與患病率也有平行的趨勢［7-8］。糖尿病腎病是糖尿病患者生活質量和生存時間的獨立危險因素，是我國新發慢性腎衰竭的重要病因，是腎臟透析的主要原因之一［9］。已有明確的研究表明糖尿病腎病的發病機制是多因素且較為復雜，主要涉及代謝紊亂、糖基化終產物的堆積、炎癥反應、氧化應激、內質網應激和巨自噬/自噬等因素［10-12］。由于其代謝紊亂極為復雜，一旦發展到ESRD，往往比其他腎臟疾病的治療更加困難，大多需終身替代治療或者進行腎移植。因此探索糖尿病腎病發病機制相關信號通路和分子對早期防治、延緩糖尿病腎病具有重大意義。

本研究通過生物信息學的方法，篩選和分析eDN 組和NC 組患者之間差異表達基因。eDN 組有1 859個差異表達基因，其中有1 063個表達上調，有796個表達下調。KEGG通路富集顯示，“JAK-STAT通路”、“細胞因子受體通路”、“趨化因子信號通路”、“細胞黏附分子通路”、“細胞外基質受體相互作用通路”等炎癥相關通路異常激活，與既往研究一致，炎癥反應、細胞因子及趨化因子異常表達在糖尿病腎病的發生發展中占據很重要的地位［13］。本研究表明免疫介導的炎癥是腎臟損傷的主要潛在機制相符合［14］。

Janus 激酶/信號轉導和轉錄活化因子即JAKSTAT 信號通路是體內重要的信號轉導途徑，主要由酪氨酸激酶JAK、酪氨酸激酶相關受體以及轉錄因子STATs 所構成，在機體中可以發揮信號轉導和基因轉錄活化子蛋白的雙重作用，是多種細胞因子受體和生長因子主要信號傳導的核心［15］。JAK-STAT 信號通路在機體內參與多種生理學過程，其中免疫炎癥反應是其主要的作用靶點之一，參與從免疫感染到免疫耐受等免疫過程，該通路異常激活近些年在糖尿病和代謝性疾病方面備受關注［15］。大量研究表明高血糖、糖基化終末產物、炎性物質、多種細胞因子等觸發分子可激活JAK-STAT 信號通路，從引起一系列炎癥反應，進而參與增殖及纖維化而影響糖尿病腎病的發生發展［16-18］。WANG 等［16］研究發現白芍總苷可產生保護腎臟作用，通過抑制JAK2/STAT3 通路和巨噬細胞增殖能力，從而顯著抑制糖尿病腎病進展。慢性糖尿病狀態下，糖基化終末產物累積，可上調JAK2/STAT3 信號通路，促進炎癥和凋亡，誘導糖尿病腎病的發生［19］。有研究報道［20］，高血糖可調節腎小球系膜細胞中的JAK2 和STAT1、STAT3 和STAT5 活性，并證實高血糖以JAK2-STAT1 依賴性方式刺激腎小球系膜細胞中TGF-β 和纖連蛋白的產生，進而導致糖尿病腎病的發生與發展。另有研究報道［21］，糖基化終末產物可通過受體與其配體相作用激活JAK2/STAT3 通路，誘導小鼠足細胞凋亡，從而加重糖尿病腎病的腎損傷。綜上，大量研究闡明JAK-STAT 通路在糖尿病腎病的炎癥進展中發揮著重要作用。

趨化因子是一類控制細胞定向聚集和遷移的細胞因子，其功能由趨化因子受體介導，在炎癥反應中發揮重要作用。其中有兩個主要的趨化因子亞家族：CXC 和CC，一般CXC 趨化因子的成員對中性粒細胞具有趨化性，CC 趨化因子對單核細胞和淋巴細胞亞群具有趨化性［22］。CC 基序趨化因子受體2（CCR2）與MCP-1 結合可有效刺激骨髓中單核細胞的釋放，并激活單核細胞和巨噬細胞的遷移和易位，發揮相應的生物學作用［23］。據報道［24］，在人類和實驗模型中，MCP-1/CCR2 會導致多種腎臟疾病，包括腎移植慢性排斥反應、狼瘡性腎炎、lgA 腎病和糖尿病腎病。在UUO 模型和腎血管性高血壓模型中，研究者們使用CCR2 抑制劑或CCR2 敲除阻斷MCP-1/CCR2 信號傳導已被證明可減輕腎纖維化［25］。KITAGAWA 等［26］發現腎纖維化小鼠模型與相關臨床發現一致，證實腎臟CCR2 表達與腎纖維化和巨噬細胞聚集高度相關。MIAO等［27］研究發現CCR2 拮抗作用于局灶節段性腎小球硬化（FSGS）小鼠模型中可使蛋白尿和腎小球損傷顯著減少，改善腎功能。另有研究發現［28］，CCR2拮抗劑CCX140-B 在2 型糖尿病和大量白蛋白尿患者中的具有顯著降低白蛋白尿的作用，發揮抑制炎癥的作用。DU 等［29］研究證實Loganin 可通過糖尿病腎病中MCP-1/CCR2 信號通路抑制巨噬細胞浸潤和活化來改善糖尿病腎病的腎損傷。本次研究發現CCR2 作為HUB 基因在早期糖尿病腎病患者的組織中顯著上調，KEGG 功能富集集中聚焦于炎癥、細胞因子和趨化因子相關通路，提示CCR2 可能作為早期糖尿病腎病發病的潛在靶點，通過JAK-STAT 通路在炎癥過程中發揮作用，但其具體作用機制尚不明確，仍需要進一步深入探究。本研究通過在GEO 數據庫中檢索并獲取RNA 測序譜，利用生物信息學方法，篩選和分析eDN 組和對照組之間的差異表達基因并進行KEGG 功能富集，發現CCR2 作為HUB 基因在早期糖尿病腎病的組織中顯著上調，提示其可能通過JAK-STAT 通路參與eDN 的炎癥過程，但具體的作用機制尚不清楚，由于臨床患者的樣本量相對有限，后續仍需大量動物和臨床試驗進行更加深入與精確的驗證，其為進一步闡明eDN 發病機制提供新的潛在分子靶點，為糖尿病腎病的治療提供新的策略和思路。