青少年發病的成人型糖尿病2型的臨床與分子遺傳學研究

周知子 李秀珍 徐愛晶 梅慧芬 林云婷 曾春華 毛曉健 饒敏 劉麗

廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心遺傳與內分泌科（廣州 510623）

青少年發病的成人型糖尿病（maturity-onset diabetes of the young，MODY）是一類具有高度遺傳異質性的單基因遺傳病，常在25 歲前診斷。目前為止，根據致病基因分14 種亞型，其中由葡萄糖激酶（glucokinase，GCK）基因變異引起的MODY2（又稱GCK-MODY），呈常染色體顯性遺傳，是最常見的一種亞型［1］。歐洲流行病學調查結果顯示［2］MODY2 的患病率達1/1 000，國外多個研究顯示［3］MODY2 占MODY 的比例約為10%～60%。近期有研究指出［5］，MODY2 在中國成人糖尿病人群中的患病率約為1.3%［4］，約占MODY 的18.42%。目前對于中國兒童MODY2 的臨床特征了解甚少，缺乏GCK 基因型-臨床表型關系的研究，臨床醫生對本病認識不足，誤診率、誤治率高，尤其是嬰兒期起病的患兒，早期識別并準確診斷有助于制定合理、個性化的治療策略，減少過度醫療及不良反應，進而優化家族中其他MODY2 患者的治療方案。本課題組此前報道［6］1 例男性患兒被誤診為1 型糖尿病，予胰島素治療半年后才確診為MODY2，為了提高對MODY2 兒童患者的診斷和管理水平，本文對近年來于廣州市婦女兒童醫療中心臨床診斷并經基因確診的32 例MODY2 兒童進行臨床特征分析與分子遺傳學研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象2011年4月至2021年10月在廣州市婦女兒童醫療中心內分泌科就診，臨床診斷為MODY2 的無癥狀高血糖兒童。MODY2 的臨床診斷標準根據國際青少年糖尿病協會（ISPAD）指南［7］：（1）無糖尿病癥狀，空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）5.5～8.3 mmol/L，糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c）≤7.5%；（2）胰島β 細胞自身抗體陰性；（3）父親或母親有糖尿病病史，但無臨床癥狀或高血糖引起的并發癥，輕度的FPG 升高（5.5～8.3 mmol/L）。32 例患兒分別來自30 個無血緣關系的家庭，父母非近親婚配，病例14、病例15 為同胞兄妹，病例25、病例27 為同胞兄弟。其中男19 例，女13 例，起病年齡1 d 至18 歲，29 例是在體檢時發現FPG 升高就診，3 例（病例11、病例15、病例27）因糖尿病家族史就診，6 例（病例1-3，病例13，病例28、29）在3 個月以內起病。

所有病例均無高血糖癥狀，體格檢查均無明顯異常發現，無黑棘皮病，營養狀況正常，糖尿病自身抗體均陰性，均未發生過酮癥酸中毒。病例7在2 歲時出現癲癇，經左乙拉西坦治療控制良好，其余情況良好。

1.2 臨床資料收集（1）臨床癥狀及體征；（2）實驗室檢查結果包括空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素、C 肽、糖尿病自身抗體（谷氨酸脫羧酶抗體、抗蛋白酪氨酸磷酸酶抗體、抗胰島素抗體、抗胰島細胞抗體）；（3）治療及隨訪情況：從發現血糖升高起每3～6 個月隨訪1 次。每次隨訪記錄患兒自我末梢血糖監測水平，檢測HbA1c。每1～2年禁食8 h后進行OGTT，口服葡萄糖劑量為1.75 g/kg（最大75 g）。對所有患兒的父母親進行FPG 和HbA1c檢測。

1.3 實驗室檢查（1）FPG 測定采用酶法測定；（2）HbA1c 采用乳膠免疫凝集抑制法測定（DCA 系統，西門子，德國埃朗根）；（3）胰島素、C 肽采用化學發光免疫分析法測定（西門子，德國埃朗根）；（4）糖尿病自身抗體采用國際標準化放射配基受體結合法測定。

1.4 目的基因檢測在患兒監護人簽署知情同意書，并經我院醫學倫理委員會討論通過后（批準文號：2014-50），抽取患兒和父母外周抗凝血2 mL，采用美國QIAGEN 公司DNeasy Blood & Tissue Kit 試劑盒，提取全基因組DNA，設計引物擴增GCK 基因（NM_000162.2），引物序列見表1。擴增產物外送至華大基因公司進行Sanger 測序，測序結果與人類基因組變異數據庫（HGMD）和ClinVar 數據庫比對查新，確定變異。對于HGMD 未查找到的新發變異，利用SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster 和FATHMM 等在線工具預測致病性。對未找到GCK變異的患兒父母進行染色體微陣列分析及全外顯子測序。從全血中提取全基因組DNA 后，外送基因公司，采用Illumina HiSeq X Ten 測序平臺進行全外顯子組測序，使用BWA 等生物信息軟件對原始數據進行分析，評估測序質量并生成單核苷酸變異報告，與SNP 數據庫、千人基因組數據庫等進行比對，獲得可疑的變異位點，根據遺傳模式確定疾病基因和變異位點。

表1 GCK 基因的引物序列Tab.1 Primer for amplification of GCK gene coding sequences

2 結果

2.1 一般資料及臨床表現32 例患兒FPG 輕度升高5.9～8.3 mmol/L，均值（6.7 ± 0.6）mmol/L，隨訪4～75 個月不等，血糖維持在（6.6 ± 0.69）mmol/L，不需要任何藥物干預。起病年齡≤6 個月的6 例患兒HbA1c 3.0%～5.8%，6個月以上的患兒HbA1c 5.0%～7.0%，所有患兒HbA1c均值（5.90±0.96）%，其中10 例HbA1c ≥6.5%或OGTT 2 h 血糖≥11.1 mmol/L，為糖尿病患兒，19 例患兒提示糖耐量受損。在27 例進行了OGTT 試驗的患兒中，25 例OGTT 2 小時血糖增幅＜3.5 mmol/L，2 例（病例14、病例15）增幅＞3.5 mmol/L，分別為5.9 mmol/L 及3.8 mmol/L。31 例患兒（病例11 失訪）進行了4～75 個月隨訪，其中13 例患兒進行了OGTT 試驗，12 例2 h 血糖增幅＜3.5 mmol/L，1 例（病例9）隨訪時出現2 h 血糖增幅＞3.5 mmol/L，為4.6 mmol/L。見表2。

表2 32 例MODY2 患兒的臨床特征及隨訪Tab.2 Clinical features and Follow-up of 32 children with GCK-MODY

30 例攜帶GCK 基因變異的父母親FPG 輕度升高，均值（6.60 ± 0.43）mmol/L，HbA1c 正?；蜉p度升高，均值（6.60±0.33）%。

2.2 GCK 基因檢測結果32 例患兒共檢測到GCK 基因30 個不同的雜合子變異，包括20 個錯義變異，2 個剪接位點變異，1 個插入缺失變異，2 個無義變異及5 個移碼變異，其中5 個為新發變異［4，8-14］（表3）。對32 例患兒的父母親進行基因檢測，其中30 例患兒父親或母親檢測到與先證者相同的變異，7 例遺傳自父親，23 例遺傳自母親。有2 例患兒（病例23 及病例26）父母通過Sanger 測序、染色體微陣列分析及全外顯子檢測均未找到GCK 基因變異及其他單基因糖尿病的已知染色體微缺失或致病變異，在血糖正常的父親或母親中未發現GCK 基因變異。

表3 32 例MODY2 患兒的GCK 基因變異特征Tab.3 Characteristics of GCK gene variation in 32 patients with MODY2

3 討論

GCK 是葡萄糖代謝中的關鍵酶，控制葡萄糖介導的胰島素分泌。GCK 基因在常染色體顯性遺傳模式下，雜合失活變異可導致MODY2，在常染色體隱性遺傳模式下，純合或復合雜合失活變異可導致永久性的新生兒糖尿?。?5］。國外文獻報道GCK 因雜合失活變異是兒童無癥狀偶發性高血糖的常見病因［16-17］。本研究對中國32 例MODY2 患兒及其父親/母親進行臨床特征分析及分子遺傳學研究并隨訪，并對患兒的基因型-臨床表型關系進行分析。MODY2 的典型特征是無癥狀的空腹高血糖，與常見的1 型或2 型糖尿病相比，MODY2并發癥少，常不需要藥物治療，無酮癥傾向，無胰島β 細胞特異性自身抗體或胰島素抵抗，目前確診依靠基因分析。

既往認為MODY2 為青少年起病，但在本研究中，7 歲前起病的病例數占47%（15/32），其中6 例（19%）患兒3 個月以內起病。病例2 生后診斷為新生兒糖尿病，3 個月大時口服格列苯脲治療，在1 歲4月齡時，行GCK 基因檢測確診MODY2，停用格列苯脲，停藥后隨訪62 個月，患兒FPG 和HbA1c穩定在5.8～6.5 mmol/L和6.2%～6.7%。在2歲7月齡時OGTT 顯示FPG 受損，但2 h 血糖水平正常。病例28、29 出現時，筆者已對MODY2 有所認識，因而在新生兒期即明確了診斷，避免了患兒進行不必要的治療。病例29 生后因“宮內感染”轉新生兒科住院，生后1 d 發現FPG 升高，住院期間監測FPG 波動于6.6～7.4 mmol/L，餐后2 h 血糖波動于6.7～8.8 mmol/L，為本組診斷年齡最小病例。6 例患兒隨訪5～75 個月不等，隨訪監測血糖穩定。本研究表明，MODY2 的空腹高血糖出生時即可存在，在嬰幼兒期（包括新生兒期）出現持續的輕度高血糖要注意MODY2 的可能，這與RUDLAND［18］報道的相一致。

通常MODY2 患者FPG 在5.4～8.3 mmol/L 之間［19］，典型的≥40 歲MODY2 患者HbA1c 在5.9%～7.6%之間［20］。本組研究中患病的父親/母親FPG在5.9～7.8 mmol/L 之間，HbA1c 在5.9%～7.3%之間，未予藥物治療下未發現與糖尿病相關的并發癥。OGTT 2 h 血糖增量＜3.5 mmol/L 是MODY2 與其他類型MODY 區別的特征之一［21］，但由于OGTT變異較大，當增量＞3.5 mmol/L 時也不能完全排除MODY2［22］。這一觀點在本研究中也得到了驗證，本組病例中除病例14、15 外，其余病例確診時OGTT 2 h 血糖增高幅度均＜3.5 mmol/L，13 例隨訪時進行了OGTT試驗，除病例9外增幅均＜3.5 mmol/L。

2 型糖尿病在中國的患病率很高，而且很多2 型糖尿病的兒童并不肥胖［23］，根據臨床特征難以有效區分非肥胖的兒童2 型糖尿病前期階段和MODY2，因此對該部分兒童進行GCK 基因分析非常必要。

HGMD 專業版數據庫目前收錄已報道GCK 基因變異976 種（http：//www.hgmd.cf.ac.uk），包含錯義、無義、移碼、插入缺失、重復和剪接位點變異。本研究中家族中所有發生了GCK 基因變異的父親/母親均有輕度糖尿病或血糖升高，而非糖尿病或血糖正常親屬中則沒有檢測到GCK 基因變異。GCK 基因變異廣泛分布于9 個外顯子（除1 號外顯子外），未發現熱點變異，變異類型以錯義變異最常見（67%），其他變異類型包括剪接（7%）、插入缺失（3%）、無義（7%）和移碼（16%），每種變異所導致的臨床表型無明顯差異，與STRIDE 等［21］報道一致。

本研究發現5種新發變異，c.934delG（p.E312Kfs*41）、c.197delC（p.Pro66Glnfs*21）、c.1175G＞T（p.Arg392Leu）、c.902T＞C（p.Leu301Pro）、c.1165G＞T（p.Val389Phe），通過在線生物信息學工具預測判定為致病性變異。c.934delG、c.197delC 兩個移碼變異使終止密碼子提前，導致GCK 基因編碼蛋白縮短，其缺失位點包括了GCK 與葡萄糖及ATP相結合的氨基酸位點。與c.1165G＞T 同一位點的c.1165G＞C（p.Val389Leu）變異為已知致病變異［24］，可導致酶活性及穩定性的降低。

目前診斷MODY2 的標準均包含家族史［7，25］，MODY2 自發變異概率很低，本組病例中發現兩例自發變異病例（病例23、26），兩例病例均是在體檢中發現FPG 升高，在對其父母進行家系分析時，卻未找到與先證者一致的變異位點，隨后對患兒父母進行了染色體微陣列分析及全外顯子檢測，均未發現其他單基因糖尿病的已知染色體微缺失或致病變異，LOPEZ 等［26］也曾報道，在14 例GCK基因變異的MODY2 患者中發現2 例自發變異。因此對臨床表現和實驗室結果高度提示MODY2 的患者即使沒有家族史，也應進行GCK 基因分析，否則將造成漏診。

對于MODY2 患兒不需藥物干預，藥物治療對降低血糖或HbA1c 無效，長期隨訪觀察沒有增加長期糖尿病相關的微血管和大血管并發癥的風險［19］，對該部分患兒只需定期隨訪，但他們與普通人群一樣，有患1 型和2 型糖尿病的風險，如果出現新的潛在臨床特征，就需要進行重新評估和研究。基因確診有助于預測臨床病程和長期預后，制定合理的治療方案。本組研究中有16 例患兒父親/母親發現血糖升高后曾使用不同的降糖藥物治療，經基因確診MODY2 后，予停止了不必要的降糖藥物治療，隨訪過程中血糖維持穩定，既減少了治療費用，也為患者及其家庭減輕負擔及心理壓力。

本組研究是目前中國關于MODY2 患兒樣本量最大、隨訪時間最長的研究，拓展了中國人群MODY2 兒童患者的表型譜及GCK 基因變異譜。本研究發現中國MODY2 患兒臨床特征與國外報道基本一致，進一步證實了MODY2 生后即可出現空腹血糖升高，對于無家族史但臨床高度提示MODY2 的患兒也應進行GCK 基因分析。本文中沒有將MODY2 患兒的臨床特點與其他類型MODY 進行對比，未來將完善這項工作，并對自發變異的MODY2 患兒的致病機制及中國人群MODY2患兒的代謝特征進行進一步的研究。