健脾消癌方的HPLC-Q-TOF/mF指紋圖譜分析及多指標含量測定

王容容，柏正平，楊靜，王其美，陳林，盧林竹，蔣益蘭*（.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，長沙 40006；2.湖南省中醫藥研究院中藥研究所，長沙 400；.湖南中醫藥大學，長沙 40028）

健脾消癌方是湖南省名中醫蔣益蘭教授防治大腸癌的經驗方。全方由人參、白術、枳實、蛇舌草、半枝蓮、重樓、甘草等13味藥物組成。方中人參為君，合白術、茯苓、甘草為四君子湯益氣健脾，以健生化之源，而療諸虛不足，從而達到扶正固本的目的；黃芪甘溫，益氣補虛健脾為臣；枳實、郁金行氣除痞，白花蛇舌草、半枝蓮、重樓、藤梨根清熱解毒、消癰散結，法半夏燥濕化痰，薏苡仁健脾滲濕，以上共用之為佐；甘草調和諸藥為使。全方藥物配伍精要，攻補兼施，共奏益氣健脾、化瘀解毒之功，順應了大腸癌患者“虛、瘀、毒”并存的病機特點。全方扶正祛邪，標本同治，在大腸癌和大腸癌術后鞏固治療中取得滿意的臨床療效。臨床研究表明，本方能降低大腸癌患者術后復發轉移率，提高生存質量，延長生存期。動物實驗研究結果表明，健脾消癌方能有效延長大腸癌裸鼠生存期，降低裸鼠肝轉移率，降低肝組織血管內皮生長因子（VEGF）和血管內皮生長因子受體（VEGFR-2）蛋白表達；可通過調節基質金屬蛋白酶（MMP）-9、基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、VEGF等因子影響血管生成；可通過調控TGF-

β

非Smad信號通路PTEN-PI3K/AKt信號通路抑制腫瘤血管形成，從而降低結腸癌裸鼠模型轉移率，提高裸鼠體質量，抑制瘤體生長等；并可通過逆轉轉化生長因子-

β

（TGF-

β

）誘導的上皮-間質轉化（EMT）過程防治大腸癌轉移。中藥復方由多味藥物配伍而成，其有效成分多，具有多成分、多靶點、多途徑的作用特點。對中藥復方中多成分及其含量進行分析鑒定是中藥復方現代化質量控制的重要手段和趨勢。鑒于健脾消癌方防治大腸癌療效確切，有必要對其進行全面的質量控制研究。本實驗擬對健脾消癌方的指紋圖譜和多組分含量測定進行研究，以全面控制該復方的質量，通過建立健脾消癌方的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進一步采用高效液相色譜串聯飛行時間質譜對其主要化學成分進行結構鑒定，對其指標成分進行定量分析，以期為健脾消癌方制劑的研發和質量控制奠定基礎。

1 材料

1290高效液相串聯四極桿飛行時間質譜6530、Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），XPE105型析天平（精度：0.01 mg）、AL204型萬分之一電子天平、XPE105型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），HH電熱恒溫水浴鍋（江蘇中大儀器科技有限公司），101-2AB電熱恒溫鼓風干燥箱（北京中興偉業儀器有限公司），SJIA-10N-50A冷凍干燥機（寧波雙嘉化器有限公司），KM-500DB型超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）。對照品野黃芩苷（批號：110842-200403，純度：96.8%）、甘草酸銨（批號：110731-201720，純度：97.6%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：110920-201606，純度：95.4%）、新橙皮苷（批號：11857-201703，純度：97.6%）、柚皮苷（批號：110772-202116，純度：98.5%）、腺苷（批號：110879-200202，純度：98.9%）（中國食品藥品檢定研究院），蕓香柚皮苷（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號：CHB180917，純度：98.1%），甲醇為色譜純（安徽天地高純溶劑有限公司），純水（華潤怡寶飲料有限公司），甲酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

人參（

Panax ginseng

C.A.Meyer），白術（

Atractylodes Macrocephala

Koidz.），茯 苓[

Poria cocos

（Schw.）Wolf]，甘 草（

Glycyrrhiza uralensis

Fisch），法 半 夏[

Pinellia ternata

（Thunb.）Breit]，黃 芪[

Astragalus membranaceus

（Fisch.）Bge.]，白花蛇舌草（

Hedyotis diffusa

Willd），半枝蓮（

Scutellaria barbata

D.Don），枳實（

Citrus aurantium

L.），郁金（

Curcuma.wenyujin

Y.H.Chen et C.Ling），重樓[

Paris polyphylla Smith

var.

chinenisi

（Franch）Hara]，薏苡仁[

Coix lacryma-jobi

L.var.

mayuen

（Roman.）Stapf]，藤梨根（

Actinidia chinensis

Planchon），均由湖南省中醫藥研究院提供，經湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科田其學主任藥師鑒定均符合2020版《中國藥典》要求。制備10批健脾消癌方凍干粉所用的各飲片均源自道地產地或主產區。

2 方法與結果

2.1 健脾消癌方凍干粉的制備

稱取人參10 g，白術10 g，茯苓15 g，甘草6 g，法夏9 g，黃芪15 g，蛇舌草15 g，半枝蓮16 g，枳實10 g，郁金10 g，重樓10 g，薏苡仁30 g，藤梨根15 g，按10倍生藥量加水，煎煮1 h，保存藥液，藥渣再加入8倍量水，煎煮1 h，合并藥液，濃縮成近2倍水量時，放置過夜，去沉淀，繼續濃縮成1.5 g·mL備用。將其置于真空冷凍干燥機中，經預冷、抽真空、一次升華、凍干72 h，即得健脾消癌方凍干粉。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 精密稱量健脾消癌方凍干粉（樣品S1）0.5 g于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱重，超聲處理30 min（功率400 W，頻率40 kHz），放冷，稱重，用50%甲醇補足減少的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.2.2 樣品溶液制備 按照“2.1”項下凍干粉制備方法，分別制備人參、白術、茯苓、甘草、法夏、黃芪、蛇舌草、半枝蓮、枳實、郁金、重樓、薏苡仁、藤梨根凍干粉。按“2.2.1”項下方法分別制備對應藥材的樣品溶液。

2.2.3 對照品溶液 取蕓香柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、柚皮苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，置于不同量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為1.09、1.02、1.01、1.03、1.02、1.02 mg·L的單一對照品儲備液。

分別精密量取各對照品儲備液適量，置于同一20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為0.05 mg·L的混合對照品溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱為Welch UItimate AQC（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相為甲醇（A）0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～26 min，5%A；26～45 min，5%～30%A；45～63 min，30%～40%A；63～78 min，40%～48%A；78～93 min，48%～70%A；93～108 min，70%～95%A；108～113 min，95%～100%A），進樣量5 μL，柱溫30℃，流速1 mL·min，檢測波長254 nm。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度 取健脾消癌方凍干粉（樣品S1）供試品溶液，連續測定6次，以4號峰（柚皮苷）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的

RSD

均≤10.0%，表明儀器精密度良好。2.3.2 重復性 取健脾消癌方凍干粉（樣品S1）適量，按“2.2.1”項下方法平行制備供試品溶液6份，進樣測定，以4號峰（柚皮苷）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的

RSD

均≤10.0%，表明該方法重復性良好。2.3.3 穩定性 取健脾消癌方凍干粉（樣品S1）的供試品溶液適量，分別于制備后0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進樣測定，以4號峰（柚皮苷）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的

RSD

均≤10.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4 指紋圖譜的建立

按“2.2.1”項下方法制備10批健脾消癌方凍干粉（樣品S1～S10）的供試品溶液，進樣測定，記錄各樣品色譜圖，見圖1。

圖1 10批健脾消癌方的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 10 batches of Jianpi Xiaoai decoction

2.4.1 參照峰的選定 在10批健脾消癌方凍干粉指紋圖譜中，柚皮苷色譜峰保留時間適中、峰面積大且穩定、分離度好，故選用柚皮苷（峰4）為參照峰。

2.4.2 相似度評價及色譜峰歸屬 將10批健脾消癌方（樣品S1～S10）的指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件（2004版）中，以樣品S1色譜圖為參照圖譜，利用中位數法，設置時間窗寬度0.5 min，進行多點校正并生成對照指紋圖譜（R），計算相似度。結果共標記了10個共有峰，10批樣品的HPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.981、0.967、0.935、0.976、0.987、0.988、0.988、0.981、0.935、0.987、1.000，表明各批樣品之間差異較小，制備工藝穩定，見表1。

表1 10批健脾消癌方特征譜圖相似度
Tab 1 Similarity of characteristic spectrum of 10 batches of Jianpi Xiaoai decoction

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 對照指紋圖譜S1 1.000 0.945 0.877 0.978 0.964 0.969 0.968 1.000 0.877 0.964 0.981 S2 0.945 1.000 0.880 0.933 0.956 0.961 0.959 0.945 0.880 0.956 0.967 S3 0.877 0.880 1.000 0.884 0.890 0.889 0.887 0.877 1.000 0.890 0.935 S4 0.978 0.933 0.884 1.000 0.956 0.966 0.962 0.978 0.884 0.956 0.976 S5 0.964 0.956 0.890 0.956 1.000 0.987 0.990 0.964 0.890 1.000 0.987 S6 0.969 0.961 0.889 0.966 0.987 1.000 0.997 0.969 0.889 0.987 0.988 S7 0.968 0.959 0.887 0.962 0.990 0.997 1.000 0.968 0.887 0.990 0.988 S8 1.000 0.945 0.877 0.978 0.964 0.969 0.968 1.000 0.877 0.964 0.981 S9 0.877 0.880 1.000 0.884 0.890 0.889 0.887 0.877 1.000 0.890 0.935 S10 0.964 0.956 0.890 0.956 1.000 0.987 0.990 0.964 0.890 1.000 0.987對照指紋圖譜 0.981 0.967 0.935 0.976 0.987 0.988 0.988 0.981 0.935 0.987 1.000

將樣品S10的色譜圖與各樣品色譜圖進行比較，確定峰1為白術、法夏、茯苓、甘草、黃芪、人參、蛇舌草、藤梨根、薏苡仁、重樓共有峰；峰2為半枝蓮、枳實、蛇舌草共有峰；峰3歸屬于枳實；峰4歸屬于枳實；峰5歸屬于半枝蓮；峰6歸屬于枳實；峰7歸屬于枳實；峰8歸屬于半枝蓮；峰9為蛇舌草，重樓共有峰；峰10為法半夏，甘草共有峰。根據對照品信息指認了6個色譜峰，分別為3號峰（蕓香柚皮苷），4號峰（柚皮苷），5號峰（橙皮苷），6號峰（野黃芩苷），7號峰（新橙皮苷），10號峰（甘草酸銨），見圖2～3。

圖2 混合對照品HPLC圖Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substance

2.5 健脾消癌方LC-MS分析

液相條件同“2.2.4”項下離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；ESI源溫度325℃；脫溶劑350℃；源電壓4.0 kV；檢測電壓1.0 kV；碰撞電壓130 V；霧化氣（N）流速為8 L·min。通過正負模式質譜分析發現，復方在負離子模式下的質譜信息響應較好，見圖4，根據其質譜信息和裂解規律，文獻數據進行結構鑒定，共確定34個化學成分，結果見表2。

圖4 健脾消癌方總離子流色譜圖Fig 4 Total ion flow chromatogram of Jianpi Xiaoai decoction

表2 健脾消癌方的LC-MS分析結果
Tab 2 LC-MS of Jianpi Xiaoai decoction

峰號tR /min 離子模式 實測m/z 分子式 二級特征碎片 鑒定結果 來源1 6.750[M－H]－ 191.0198C6H8O7 111.0103，147.0320 檸檬酸 藤梨根2 7.660[M－H]－ 989.3359C34H18N6O3 179.0584，31.1136，503.1683，665.2233，827.2814未知3 8.267[M－H]－ 243.0622C9H12N2O6 200.0597，152.0383，130.9701，110.0285 尿苷 茯苓/法夏4 11.266[M－H]－ 389.1173C16H22O11 137.0619，209.0489，323.0327 未知5 11.300[M＋HCOO]－ 312.0989C10H13N5O4 266.1040，134.0614，117.0347 腺苷 法夏6 15.478[M－H]－ 282.0918C10H13N5O5150.0447 鳥苷 法夏7 16.961[M－H]－ 344.0516C16H11NO8 150.0465 未知8 31.485[M－H]－ 389.1212C17H18N4O7 101.0280，139.0439，147.0485，165.0620，183.0726，209.0526，227.0637未知10 44.357[M－H]－ 339.0845C13H16N4O5S177.0240 未知11 47.491[M－H]－ 515.1626C22H28O14 161.0278，469.1511 未知12 48.300[M＋HCOO]－ 531.1551C21H10O14 177.0243，485.1472 未知13 55.511[M－H]－ 593.1703C27H30O15 353.0781，473.1229 維采寧-2 半枝蓮14 56.387[M－H]－ 163.0443C9H8O3 119.0532 4-香豆酸 藤梨根15 57.702[M－H]－ 649.2748C38H38N2O8 174.9612，242.9482，347.1954，443.2229，605.2839未知16 59.757[M－H]－ 595.1882C27H32O15 287.0660，151.0087 圣草次苷 枳實17 59.858[M－H]－ 741.2534C38H38N4O10151.0081，271.0717，339.0842，459.1479，621.1913未知18 61.038[M－H]－ 491.1320C29H20N2O6 268.0485，283.0715 未知19 61.341[M－H]－ 417.1367C21H22O9 255.0747，135.0131，119.0542 甘草苷 法夏/甘草20 62.790[M－H]－ 549.1805C26H30O13 417.1344，255.0745，135.0132 芹糖甘草苷 法夏21 63.295[M－H]－ 463.1236C21H20O12 287.0660，269.0553，243.0729，225.0649，193.0396，181.0185，167.0037，153.0241，139.0077紅花素 7-O-葡糖苷酸 半枝蓮22 64.070[M－H]－ 623.2229C29H36O15 461.1849，179.0396，161.0295 毛蕊花糖苷 半枝蓮23 66.025[M－H]－ 579.1946C27H32O14 271.0719，151.0090 蕓香柚皮苷 枳實24 68.114[M－H]－ 579.1911C27H32O14 271.0698，151.0078 柚皮苷 枳實25 69.294[M－H]－ 609.2005C28H34O15 301.0796 橙皮苷 枳實26 69.664[M－H]－ 623.2199C29H36O15 461，1813，315.1182，251.1182，179.0396，161.0290毛蕊花糖苷異構體 半枝蓮27 70.102[M－H]－ 461.0789C21H18O12 285.0414，267.0313，239.0358，175.0239，166.9980，136.9869野黃芩苷 半枝蓮28 71.383[M－H]－ 609.1992C28H34O15 301.0796 新橙皮苷 枳實29 83.413[M＋HCOO]－ 639.2017C27H30O15 593.2018，473.1536，285.0829 山柰酚-3-O-（6-O-α-L-鼠李糖基）-β-D-吡喃葡萄糖苷蛇舌草30 84.997[M－H]－ 461.0829C21H18O12 285.0463，257.0320，241.0554，213.0591，175.0296，145.0347異黃芩素 7-O-β-D-葡糖苷酸 半枝蓮31 88.266[M－H]－ 1017.4450C41H14N8O25277.1021，607.2902，885.3972 未知32 90.018[M＋HCOO]－ 845.5108C42H72O14 799.5034，637.4463，475.3898，161.0481，119.0373人參皂苷Rg1 人參33 91.939[M－H]－ 1059.4508C44H16N6O27867.3827，927.4046，999.4292 未知34 102.486[M－H]－ 821.4104C42H62O16 351.0593，469.3353，627.3578，645.3691，759.4006甘草酸銨 甘草

2.6 多指標成分的含量測定

2.6.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.3”項下各單一對照品儲備液適量，分別稀釋成一系列不同質量濃度的溶液，按“2.2.4”項下方法進樣測定，記錄色譜峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，當儀器信噪比（

S/N

）＝3時為檢測限，

S/N

＝10時為定量限。結果見表3，6種成分在相應質量濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系。

表3 健脾消癌方中6種指標成分的線性關系考察
Tab 3 Linearity of 6 components in Jianpi Xiaoai decoction

成分 線性回歸方程 R2 范圍/（mg·mL－1） 檢測限/（μg·mL－1） 定量限/（μg·mL－1）蕓香柚皮苷 y＝2×106x＋1.66×104 0.9999 0.011～4.352 0.78 2.72柚皮苷 y＝2×106x＋3.72×104 0.9995 0.010～5.105 0.73 2.55橙皮苷 y＝1×106x＋1.61×104 0.9999 0.010～4.072 1.02 3.39新橙皮苷 y＝2×106x＋1.26×104 0.9998 0.010～4.120 0.74 2.58野黃芩苷 y＝4×106x－5.33×104 0.9999 0.010～4.024 0.50 1.68甘草酸銨 y＝4×106x＋2.46×104 0.9997 0.020～3.054 0.51 1.71

2.6.2 精密度試驗 取混合對照品溶液，連續進樣6次，結果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、甘草酸銨峰面積的

RSD

分別為2.3%、0.67%、6.7%、0.70%、0.19%、4.2%，表明儀器精密度良好。

圖3 健脾消癌方HPLC指紋圖譜色譜圖Fig 3 HPLC fingerprint chromatogram of Jianpi Xiaoai decoction

2.6.3 穩定性試驗 取同一健脾消癌方凍干粉（樣品S1）供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進樣測定，結果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、甘草酸銨峰面積的

RSD

分別為2.2%、1.3%、5.6%、0.80%、0.30%、3.9%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。2.6.4 重復性試驗 取同一健脾消癌方凍干粉（樣品S1）的供試品溶液6份，進樣測定，記錄色譜圖，結果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、甘草酸銨平均質量分數分別為1.59、12.97、2.94、1.33、6.96、0.93 mg·g，

RSD

分別為4.8%、8.9%、5.2%、5.0%、8.6%、3.7%，表明該方法重復性良好。2.6.5 加樣回收試驗 稱取已知各指標成分含量的健脾消癌方凍干粉（樣品S1）約0.125 g，精密稱定，平行6份，分別按照樣品中相對應成分含量1∶1加入各對照品溶液。制備供試品溶液后進行測定，結果蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸銨、橙皮苷、野黃芩苷的平均加樣回收率分 別 為101.58%、102.94%、103.48%、100.05%、99.32%、100.08%，

RSD

分別為2.2%、2.2%、3.0%、0.50%、5.3%、4.8%，表明該方法準確可靠。

2.6.6 樣品測定 取10批健脾消癌方凍干粉（樣品S1～S10），制備供試品溶液，進行測定，計算6個指標成分的含量。結果10批健脾消癌方凍干粉中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、甘草酸銨質量分數范圍分別為1.80～2.55、12.90～17.86、3.49～5.28、1.26～1.82、6.93～9.47、1.05～1.51 mg·g，見表4。

表4 10批健脾消癌方中6個指標成分的含量(mg·g)
Tab 4 Content of 6 components in 10 batches of Jianpi Xiaoai decoction (mg·g)

序號 蕓香柚皮苷 柚皮苷 橙皮苷 野黃芩苷新橙皮苷甘草酸銨S1 1.88 15.73 5.03 1.82 8.34 1.05 S2 2.33 17.86 5.28 1.64 9.05 1.43 S3 1.80 12.90 3.49 1.26 6.93 1.13 S4 2.20 16.83 4.61 1.65 9.04 1.51 S5 2.03 14.92 4.14 1.47 8.03 1.28 S6 2.42 17.47 4.85 1.70 9.47 1.46 S7 2.17 16.01 4.53 1.51 8.60 1.22 S8 2.55 16.99 4.79 1.64 9.19 1.28 S9 2.06 14.78 4.14 1.39 7.99 1.15 S10 2.31 16.95 4.60 1.60 9.15 1.29

3 討論

本文首次建立了健脾消癌方中蕓香柚皮苷、野黃芩苷等6種活性成分含量的HPLC-Q-TOFmF法，該方法分離度好、準確度高，對于控制健脾消癌方配伍前后化學成分性質和含量變化及作用具有重要意義。6種活性成分中，野黃芩苷來源于半枝蓮，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷來源于枳實，甘草苷來源于甘草/法夏。研究表明，野黃芩苷能夠抑制結腸腫瘤干細胞的體外和體內分化，其作用機制在于下調hedgehog信號通路活性；野黃芩苷與順氯氨鉑（DDP）聯用可提高肺癌A549/DDP細胞對DDP的敏感性，抑制克隆形成，其機制可能與下調c-met蛋白表達有關；熊果酸能抑制結腸癌細胞增殖及誘導結腸癌細胞凋亡；

β

-谷甾醇通過與大腸癌中的p53-MDM2相互作用，抑制多藥耐藥，還可以協同吉西他濱調節細胞凋亡和通過抑制Akt/GSK-3

β

信號轉導抑制上皮-間質轉化發揮抗胰腺癌活性；人參皂苷是人參發揮抗癌活性的主要成分，如人參皂苷Rh、人參皂苷-Rh-qt、人參皂苷-Rh-qt和人參二醇都具有誘導腫瘤細胞周期停滯，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長，抗腫瘤血管生成的作用，并在免疫浸潤、慢性炎癥損傷、腸道菌群、化療耐藥等研究中展示出良好的潛力；異甘草素可抑制骨肉瘤細胞的增殖、凋亡和遷移。當然，復方中藥配伍后的化學成分并不是單味藥物化學成分的簡單相加，其提取過程中各化學成分也會產生變化，這可能是復方配伍的精髓，也是研究開發復方新藥的有效依據。本課題組后續將嘗試增加皂苷類、酚酸類及多糖類的指標成分，對健脾消癌方的有效成分和作用機制進一步研究，將名老中醫經驗方制備方式、方法標準化。經驗方物質基礎的研究對中藥復方制劑的開發起著關鍵作用。本研究建立的10批健脾消癌方凍干粉HPLC指紋圖譜相似度高、分離度好，對蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、甘草酸銨6種指標性成分進行定性和定量分析，較為全面地反映了該復方化學成分信息，可為該復方藥效活性物質作用機制研究提供科學依據，為健脾消癌方復方制劑的研發提供參考。