蕎麥抗性糊精制備工藝的條件優化及其結構表征

蘇有韜, 王維浩,2, 魏春紅, 武云嬌, 王一飛, 趙姝婷, 劉德志, 曹龍奎,2

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319) (黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術研究中心2，大慶 163319)

膳食纖維具有調節血糖[1，2]，血脂和腸道菌群的作用[3]。根據其溶解性，又可分為水溶性膳食纖維(SDF)和水不溶性膳食纖維(IDF)[4]，抗性糊精是一種小分子SDF，又稱作難消化糊精，是一種以淀粉為原料深加工的產物，具有耐消化和良好的加工特性，如熱穩定，易溶于水和低黏度等特點，在面包中應用可以改善面包的口感和色澤[5]；在飲料加工中可以代替高能量飲料中部分脂肪和糖類，開發出低GI飲料[6]；添加到乳制品中可以強化乳品中所缺少的膳食纖維，并不會影響乳品本身的質構；因抗性糊精具有抑制血糖和胰島素的上升，所以在保健品等領域也有涉及[7-9]。

蕎麥是一種重要的功能性食品，其主要組成成分為淀粉，質量分數為60%～70%[10]。蕎麥淀粉在工業上被廣泛應用，但在食品工業上研究較少[11]，將蕎麥淀粉加工成抗性糊精，應用到食品加工工業上[12]，將具有非常大的潛力，同時也拓展了蕎麥淀粉在食品領域的應用前景。因此，本研究將以蕎麥淀粉為原料，利用酸熱法制備蕎麥抗性糊精，探究糊精化前后二者在結構上的差異，并為蕎麥抗性糊精在食品領域的應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

蕎麥米、耐高溫α-淀粉酶(4×104U/g)、淀粉葡萄糖苷酶(1×105U/mL)；溴化鉀:光譜級；鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、水楊酸、無水乙醇：分析純。

SU8020場發射電子掃描電子顯微鏡，D8 ADVANCE X射線衍射儀，NP-800PRF偏光顯微鏡，Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，WSC-S測色色差儀，DGG-9053A型電熱鼓風干燥箱，DK-S24型恒溫水浴鍋，TGL16B型臺式離心機。

1.2 方法

1.2.1 蕎麥淀粉的提取

蕎麥淀粉的提取參照周小理等[10]的方法，稱取新鮮蕎麥500 g，進行除雜清洗，多次水洗后，按照水與蕎麥質量比1∶2.5進行浸泡，再加入4 g的無水硫酸鈉固體粉末，用鹽酸(1 mol/L)調節pH到2，于35 ℃下浸泡24 h后，換水磨漿4次，并多次過濾，直到充分洗出淀粉，再將濾液離心(5 000r/min，10 min)得到粗淀粉，將粗淀粉經鹽酸(0.01 mol/L)漂洗，蕎麥粗淀粉與洗液質量比為1∶10，漂洗3次后離心(5 000 r/min，10 min)；再經NaOH(0.000 1 mol/L)漂洗，蕎麥粗淀粉與洗液質量比為1∶15，漂洗3次，離心，沉淀溶解于蒸餾水，調溶液pH到7，離心(5 000 r/min，10 min)后除去上層及底部殘渣，放置烘箱45 ℃干燥48 h，得蕎麥淀粉，得率為(58.9±2.71)%。

1.2.2 蕎麥抗性糊精的制備工藝

蕎麥抗性糊精的制備參考文獻[13]的方法，并加以修改，具體操作為：稱取一定量的蕎麥淀粉，用0.1 mol/L鹽酸進行噴灑加入淀粉中，進行攪拌混勻，保證淀粉與鹽酸充分接觸，獲得以干淀粉為基礎的0.15%的最終鹽酸濃度，再放入烘箱(溫度55 ℃)干燥到水分<5%，再放入烘箱高溫熱解，熱解溫度160 ℃，熱解時間100 min，即可得到粗品糊精，加3倍淀粉質量的蒸餾水溶解，在用濃度為0.1%鹽酸溶液和0.1%氫氧化鈉溶液調節pH至5.5，加入1%的耐高溫α-淀粉酶，并水浴加熱(95 ℃、2 h)，滅酶(100 ℃，10 min)，再調節pH至4.5，加入0.1%的淀粉葡萄糖苷酶水浴加熱(55 ℃、4 h)，滅酶(100 ℃，10 min)；放入離心機進行離心(4 000 r/min、10 min)，在加入3倍液體體積的95%的乙醇，邊加入邊攪拌至沉淀產生，靜置4 h后，倒掉上清液，沉淀55 ℃烘干至恒重，得到蕎麥抗性糊精，計算公式為：

式中：m為蕎麥抗性糊精得率/%；m1為蕎麥抗性糊精質量/g；m2為蕎麥淀粉質量/g。

1.2.3 蕎麥抗性糊精DE值測定[14]

采用3.5-二硝基水楊酸比色法進行糊精DE值測定。

1.2.3.1 制作葡萄糖標準曲線

利用3.5-二硝基水楊酸比色法測定葡萄糖含量，準確稱取已烘至恒重的葡萄糖100 mg，溶解定容至100 mL容量瓶中，移取0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、0.11 mL上述標液于25 mL具塞刻度試管中，加入蒸餾水補至2 mL，分別加入2 mL 3.5-二硝基水楊酸試劑后于沸水浴中加熱5 min，流水迅速冷卻，轉移至25 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，用分光光度計在波長為520 nm 處測定吸光度，繪制標準曲線。標準曲線回歸方程為y=6.533 6x+0.036，R2=0.997 0，y為標準溶液在520 nm處吸光度，x為葡萄糖含量/(mg)。

1.2.3.2 樣品測定

樣品適當稀釋后，使其質量濃度為0.2 mg/mL，取稀釋液2 mL，加入2 mL 3.5-二硝基水楊酸試劑后于沸水浴中加熱6 min，流水迅速冷卻，轉移至25 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，用分光光度計在520 nm波長處測定吸光度，計算出樣品中還原糖含量。

1.2.3.3 葡萄糖當量(DE)值的測定

式中：DE為葡萄糖當量值/%；C1為還原糖含量/g/mL；C2為總固形物含量/g/mL。

1.2.4 蕎麥抗性糊精的色度[15]

采用WSC-S測色色差儀測定。結果用L*、a*、b*3個參數表示；其中L*表示亮(白)度,a*表示紅色至綠色, b*表示黃色至藍色。

1.2.5 蕎麥抗性糊精單因素實驗方法1.2.5.1 鹽酸添加量對得率的影響

稱取10.00 g蕎麥淀粉，噴灑鹽酸，獲得以干淀粉為基礎的0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的最終鹽酸濃度，酸熱溫度160 ℃，酸熱時間100 min，酶解，離心取上清液，醇沉，干燥稱重，得到蕎麥抗性糊精，計算得率。

1.2.5.2 酸熱溫度對得率的影響

稱取10.00 g蕎麥淀粉，噴灑鹽酸，獲得以干淀粉為基礎的0.15%的最終鹽酸濃度，酸熱溫度120、140、160、180、200 ℃酸熱時間100 min，酶解，離心取上清液，醇沉，干燥稱重，得到蕎麥抗性糊精，計算得率。

1.2.5.3 酸熱時間對得率的影響

稱取10.00 g蕎麥淀粉，噴灑鹽酸，獲得以干淀粉為基礎的0.15%的最終鹽酸濃度，酸熱溫度160 ℃，酸熱時間60、80、100、120、140 min，酶解，離心取上清液，醇沉，干燥稱重，得到蕎麥抗性糊精，計算得率。

1.2.6 蕎麥抗性糊精正交優化實驗

在單因素實驗的基礎上進行正交實驗設計，以鹽酸添加量、酸熱溫度和酸熱時間為單因素，蕎麥抗性糊精得率和DE值為指標，采用L9(34)進行優化最佳制備工藝。設計制備工藝水平表，見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.7 蕎麥淀粉與蕎麥抗性糊精的微觀結構1.2.7.1 偏光十字測定方法[16]

稱取一定質量蕎麥淀粉于離心管中，配置1%的淀粉溶液，抗性糊精則用95%乙醇配置，取0.1 mL溶液于載玻片上，蓋上載玻片，將氣泡趕走，在合適的放大倍數下在偏光顯微鏡下觀察淀粉和抗性糊精。

1.2.7.2 掃面電鏡測定方法[17]

取適量樣品，將其分散于貼有雙面膠的樣品臺上，通過離子濺射噴金使樣品導電后，之后置于掃描電子顯微鏡，20 kV加速電壓下分別調整放大倍數，觀察5.00 μm和50.00 μm下蕎麥淀粉和蕎麥抗性糊精的表面結構。

1.2.8 紅外光譜測定方法

利用傅里葉紅外光譜儀進行測定，將蕎麥淀粉和蕎麥抗性糊精分別與KBr混合研磨，利用真空壓片機進行壓片，在4 000～400 cm-1范圍進行紅外光譜掃描。

1.2.9 X-射線衍射測定方法[18]

將蕎麥淀粉及蕎麥抗性糊精進行干燥、粉碎，采用X-射線衍射儀測定。

1.2.10 分子質量測定方法[19]

參照王娟等方法，稱取適量樣品于容量瓶中，用流動相溶解，定容。色譜條件：色譜柱：TSKgel GMPWXL,流動相：水相，少量硝酸鈉、疊氮化鈉，流速：0.5 mL/min, 柱溫：30 ℃,進樣量：20 μL。

1.2.11 數據處理與分析

所有實驗均進行3次平行，取其平均值，采用SPSS 26.0對數據進行處理并分析，采用 ANOVA 對數據進行差異顯著性分析(P<0.05)；采用origin 9.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

從圖1可以看出，隨著鹽酸添加量的增加，蕎麥抗性糊精的得率也隨之增加，在鹽酸質量分數為0.2%左右得率趨于平穩，相關研究表明，鹽酸添加量增多，會使蕎麥淀粉降解出小分子物質，加劇了小分子物質在高溫條件下重新聚合，能被α-淀粉酶和糖化酶酶解的糖苷鍵被破壞，形成了不被酶解的糖苷鍵，例如α-1,2、α-1,3、β-1,2和β-1,6 糖苷鍵，但隨著鹽酸添加量增加，發生了熱降解，單糖從抗性糊精上脫落，生成大量小分子單糖，單糖含量變多，經過酶解，生成大量還原糖，DE值反映了抗性糊精經過醇沉，其中還有經過酶解殘留的還原糖，因此DE值增高；同時抗性糊精顏色會發生變化，由白色逐漸變成黃色，并伴隨有焦糊氣味產生，會不利于抗性糊精后期的脫色處理，所以在鹽酸質量分數0.2%最好[20]。

制備蕎麥抗性糊精，固定鹽酸質量分數為0.15%，酸熱時間為100 min。從圖1可以看出，蕎麥抗性糊精的得率與酸熱溫度升高呈線性關系，溫度越高，得率越增加，在升高至160 ℃之后得率緩慢增加，達到200 ℃含量有所下降，DE值隨著溫度升高而降低，到160 ℃開始升高，這是因為蕎麥淀粉經過酸解和高溫，生成不被α-淀粉酶和糖化酶酶解的新結構，抗性含量增加，得率增加，DE值降低，在更苛刻的條件下，會有更大程度的轉葡萄糖和再聚合的可能發生，導致抗性糊精與分子質量略有增加，但也會含有較短的支鏈產生[21]，同時生成小分子物質，在較低溫度下，不利于其再聚合，單糖含量增大，抗性糊精得率下降很多，在經過酶解，生成大量還原糖，DE值含量增大表示抗性糊精中有部分還原糖，在高溫條件下，熱分解導致得率下降，大量小分子單糖脫落，也會導致DE值增大，同時糊精顏色逐漸由白色變成黃褐色，水溶性增加，并伴隨產生焦糊味，不利于對后期的處理，最佳酸熱溫度為160 ℃。

制備蕎麥抗性糊精，固定鹽酸質量分數為0.15%，酸熱溫度160 ℃。從圖1可以看出，隨著酸熱時間的增加，抗性糊精的得率也隨之增加，在時間100 min時，得率趨于平穩，達到51%不再增加，同時抗性糊精顏色隨時間的增大而逐漸由白色變成黃褐色，總體來看，酸熱時間對抗性糊精的得率影響趨勢不大，DE值在時間120 min時達到最低，達到20.2%，繼續增加酸熱時間不利于抗性糊精的形成，經過酶解，反而會使殘留的抗性糊精中還原糖增加，導致了DE值增大，為后期進一步純化處理很麻煩，不利于在食品工業上計算成本和效率問題，因此，最佳酸熱時間為120 min。

圖1 不同條件對抗性糊精得率和DE值的影響

2.2 蕎麥抗性糊精正交優化實驗分析

正交實驗結果見表2，方差分析見表3、表4，通過R值的大小可知，影響得率的因素排序為鹽酸添加量>酸熱溫度>酸熱時間，影響DE值的因素排序為鹽酸添加量>酸熱溫度>酸熱時間，通過表3和表4可知鹽酸添加量和酸熱溫度對得率影響極顯著(P<0.01)，酸熱時間顯著(P<0.05)，鹽酸添加量和酸熱溫度對DE值影響顯著(P<0.05)，酸熱時間不顯著；影響得率的最優組合為A2B2C2，影響DE值的最優組合為A2B2C1，根據能耗和成本計算綜合考慮，確定蕎麥抗性糊精制備工藝最優組合為A2B2C1，即鹽酸質量分數為0.2%，酸熱溫度180 ℃，酸熱時間100 min。

表2 正交實驗結果

表3 蕎麥抗性糊精制備工藝優化得率方差分析表

表4 蕎麥抗性糊精制備工藝優化DE值方差分析表

2.3 驗證實驗

通過正交實驗確定最佳工藝條件為鹽酸添加量為0.2%；酸熱溫度180 ℃；酸熱時間100 min；結果表明，蕎麥抗性糊精得率為(56.8±0.45)%，DE值為(19.9±0.71)%，高于單因素最佳得率和低于單因素最佳DE值，證明該工藝可行性。

2.4 淀粉與抗性糊精色度分析

如表5所示，蕎麥淀粉制備蕎麥抗性糊精其顏色變化明顯，這是由于在高溫條件下，淀粉發生焦糊化反應，顏色由白色變為黃色，L*由93.62降低到45.95，代表顏色更偏離白色；a*由0.43升高到7.05，代表顏色更偏向紅色；b*由4.11升高到7.03，代表顏色更偏向黃色。

表5 蕎麥淀粉與蕎麥抗性糊精色度

2.5 微觀結構測定結果與分析

2.5.1 偏光十字測定結果與分析

由圖2a可知，蕎麥淀粉的雙折射現象呈現出偏光十字，這是淀粉球晶結構所具有的，這種變化在一定程度上反映了蕎麥淀粉支鏈的螺旋形成結晶的徑向取向和蕎麥淀粉的結晶結構[22，23]。由圖2b可知，淀粉特有的結晶結構已破環，無法觀察到偏光十字，呈碎片狀，由于淀粉通過酸熱處理，使淀粉的結構發生了改變。

圖2 蕎麥淀粉與蕎麥抗性糊精偏光十字圖(×400)

2.5.2 掃描電鏡測定結果與分析

由圖3可以觀察出由蕎麥淀粉變成蕎麥抗性糊精，結構發生了明顯的改變，證實了嚴酷的條件可以有效地摧毀了淀粉顆粒內部有秩序的結構[21]。左側蕎麥淀粉形狀多是球形和不規則的多面體形，顆粒較小，而右側蕎麥抗性糊精則失去淀粉原有的結構，呈現出小碎片和小碎片聚合的塊狀，這是因為淀粉分子在酸熱過程中，失去了原有的分子結構，形成了很多鏈狀結構和單糖，又重新進行無規律的聚合，進行酶解純化后，形成大小不一，無規則，多孔狀結構，導致水分子有利于滲透，使水溶性增加。

圖3 蕎麥淀粉與蕎麥抗性糊精的掃描電子顯微鏡圖

2.5.3 紅外光譜測定結果與分析

圖4 蕎麥抗性糊精(A)與蕎麥淀粉(B)的紅外光譜圖

2.5.4 X-衍射測定結果與分析

從圖5觀察蕎麥淀粉和蕎麥抗性糊精的XRD衍射結果，蕎麥淀粉的晶型是A型，在2θ為15.35°、17.12°、18.03°、23.43°出現衍射峰，與現有研究一致[24]；由淀粉制備抗性糊精，晶型發生了很大的改變，原有的衍射峰消失，在20°左右出現衍射峰，晶型屬于非晶型，可以得知，經過酸解和高溫的處理，淀粉的結構發生了明顯的改變，與抗性糊精明顯不同，通過掃描電鏡觀察結果一致。

圖5 蕎麥淀粉(A)與蕎麥抗性糊精(B)的X射線衍射譜圖

2.6 抗性糊精的分子質量

通過表6可以得知蕎麥抗性糊精平均分子質量為3 895 u，相對于淀粉這種多糖聚合物，是一種小分子的物質，結合圖2，更進一步說明了結構發生了明顯變化，經過破壞聚合，生成了糖類物質，可以推斷，淀粉經過酸和高溫處理，在經過酶解，結構發生了變化，鏈狀結構被破環，生成了大量小分子的多糖結構。

表6 蕎麥抗性糊精分子質量測試結果

3 結論

以蕎麥淀粉為原料，采用了酸熱法制備抗性糊精，通過單因素實驗和正交優化，確定了最佳工藝條件為鹽酸質量分數0.2%；酸熱溫度180 ℃；酸熱時間100 min；制備蕎麥抗性糊精的得率為56.8%，DE值為19.9%，通過酸熱處理，抗性糊精由白色變成黃色，水溶性增加，結構有了明顯的改變，表面粗糙疏松多孔，呈無規則形狀，平均分子質量為389 5 u，屬于小分子量的水溶性膳食纖維。