基于甘三酯指紋圖譜及化學(xué)計量學(xué)的青海亞麻籽油摻假識別研究

韓玉澤，王興瑞，董國鑫，甘生睿，王進(jìn)英,2

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院1，西寧 810016) (青海大學(xué)三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室2，西寧 810016)

亞麻是我國重要的油料經(jīng)濟作物，主要用于亞麻籽油的提取[1,2]。青海省亞麻種植歷史悠久，由于青藏高原獨特的地理、氣候特征，青海亞麻已成為一種寶貴的油料作物。亞麻籽油含有豐富的亞麻酸、蛋白質(zhì)、木酚素、亞麻籽膠、膳食纖維等對人體具有特殊營養(yǎng)功能的化學(xué)成分[3-7]，在心腦血管、糖尿病、癌癥等疾病的預(yù)防和控制中起著顯著作用[8,9]。作為高檔食用保健油，較高的市場價格使得亞麻籽油摻假現(xiàn)象多見，不僅嚴(yán)重?fù)p害消費者的利益，也影響了亞麻籽油產(chǎn)業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展。為維護(hù)食用油消費者和合法生產(chǎn)經(jīng)營者的權(quán)益，建立有效的亞麻籽油摻偽檢測方法顯得尤為重要。

目前，國內(nèi)外的油脂檢測技術(shù)主要有色譜[10-12]、光譜[13,14]、電子鼻[15]等技術(shù)。色譜技術(shù)是食用油摻偽檢測的常用手段，檢測油脂中的特征物質(zhì)組成可以對不同植物油樣品進(jìn)行區(qū)分[16]。三酰基甘油作為食用植物油的主要組成成分，占整體成分的95%～98%[17,18]，同時其組成受油脂種類影響較大，因此，可以依據(jù)甘三酯甘油骨架上結(jié)合脂肪酸的種類以及脂肪酸的分布、構(gòu)型來識別植物油種類[19]。涂安琪[20]以甘三酯作為標(biāo)記物結(jié)合化學(xué)計量學(xué)建立了橄欖油中摻假葵花籽油的定量檢測方法，可以快速有效地確定橄欖油葵花調(diào)和油中的各組分含量。任小娜等[21]采用甘三酯組成分析法以“β-LOL”和 “β-PLL” 含量之和為判斷標(biāo)準(zhǔn)對芝麻油中摻入菜籽油的鑒別方法進(jìn)行了研究。現(xiàn)有的檢測方法主要局限于單一指標(biāo)的檢測，而指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的品質(zhì)鑒定手段，將其與色譜相結(jié)合應(yīng)用于油脂檢測可以克服此缺陷。Tsimidou等[22]采用HPLC測定橄欖油中甘三酯并建立指紋圖譜，通過主成分分析法可以檢測到橄欖油中摻入10%～20%的4種低價植物油。

本研究采用HPLC-RID法全面分析40批亞麻籽油及摻入6種植物油的摻偽油樣中甘三酯的組成，建立亞麻籽油甘三酯標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜及判別分析模型，旨在為亞麻籽油的評價及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40種青海亞麻籽(詳見表1)，采用索氏抽提法制得亞麻籽油(料液比0.06 g/mL、抽提溫度70、抽提時間8 h)；菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油(金龍魚)。乙腈、異丙醇，均為色譜純。

表1 亞麻籽油信息表

1.2 儀器與設(shè)備

Shimadzu LC- 20A型液相色譜儀(配備有RID-20A示差折光檢測器、CBM-20A控制器、LC-20AD二元泵、SIL-30AC自動進(jìn)樣器、CT0-20AC柱溫箱),Inertsil ODS-C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm；5 μm),XW-80A渦旋混合器,SB-3200TDT超聲波清洗機。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取(1.0±0.01) g油樣于10 mL棕色容量瓶中，加入流動相乙腈:異丙醇(30/70)渦旋混勻1 min后定容至刻度，取混勻后的樣品溶液經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后用于液相色譜分析。

1.3.2 甘三酯測定

HPLC-RID色譜分析條件[23]：Inertsil ODS-C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)；柱溫：40 ℃；流動相∶乙腈-異丙醇(30∶70)；等度洗脫，洗脫時間30 min；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；檢測器溫度：30 ℃；

定性分析：與AOCS標(biāo)準(zhǔn)中亞麻籽油甘三酯標(biāo)準(zhǔn)色譜圖進(jìn)行對比，同時結(jié)合甘三酯等價碳原子數(shù)(ECN)越大，其保留時間越長的出峰規(guī)律對亞麻籽油各甘三酯組分進(jìn)行定性分析。

定量分析：采用峰面積歸一化法計算亞麻籽油中各甘三酯的相對含量。

1.3.3 摻偽油樣制備

在亞麻籽油中分別摻入菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油，摻入量為10%、20%、30%、40%、50%制備摻偽油樣，采用液相色譜分析摻偽油樣中甘三酯組成及含量。

1.3.4 指紋圖譜構(gòu)建

按照1.3.1方法制備樣品，采用優(yōu)化后的色譜條件測定40批亞麻籽油樣品的甘三酯組成及含量，將得到的液相色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A版得到40批樣品油原始圖譜的疊加圖及對照指紋圖譜。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)平行測定3次，結(jié)果取其平均值，利用Microsoft Excel 2010及SPSS 23.0對試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，運用origin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物油甘三酯的組成分析

參考AOCS Official Method Ce 5c-93方法[23]測定亞麻籽油及菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油共7種植物油樣品的甘三酯組成，高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

按照ECN由小到大分離甘三酯的規(guī)律并結(jié)合脂肪酸組成對樣品進(jìn)行定性分析。參考對菜籽油甘三酯的研究[24-26]，OOO(ECN=48)是菜籽油含量最高的甘三酯，因此將菜籽油色譜圖中面積最大的峰7定性為ECN 48分區(qū)。對大豆油[27]、葵花籽油[26]、玉米油[25,28]甘三酯組分的研究均表明LLO是這3種植物油中含量最高的甘三酯，該甘三酯位于ECN 44分區(qū)，因此將大豆油色譜圖中的峰5、葵花籽油中的峰4、玉米油色譜圖中的峰4定性為ECN 44分區(qū)。參考對芝麻油中甘三酯組分的研究[29,30]，OOL是芝麻油中最主要的甘三酯，該甘三酯位于ECN 46分區(qū)，因此將芝麻油中峰5定性為ECN 46分區(qū)。參考對亞麻籽油甘三酯組分分布的研究[27,31-33]，可以確定亞麻籽油色譜圖中峰1為LnLnLn(ECN 36)、峰2為LLnLn(ECN 38)、峰3為OLnLn(ECN 40)、峰4為OLLn(ECN 42)、峰5為OLnO(ECN 44)、峰6為OLnP(ECN 46)、峰7為OOO(ECN 48)、峰8為POO(ECN 48)。

表2 7種植物油甘三酯組成及相對含量/%

對高效液相色譜圖中所有甘三酯色譜峰進(jìn)行面積歸一化處理，得到每種甘三酯組分的相對含量，結(jié)果見表2。7種植物油中共檢測到11種甘三酯，其甘三酯組成及分布規(guī)律均具有獨特性。有研究表明寧夏亞麻籽油中OLnLn(17.06%)、Ln Ln Ln(12.61%)、LLn Ln(12.24%)含量較高，內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)亞麻籽油主要甘三酯為OLnLn(17.27%～20.50%)和LnLnLn(11.91%～17.02%)[33,34]。對比發(fā)現(xiàn)，我國不同產(chǎn)區(qū)亞麻籽油最主要的甘三酯均為OLnLn，其次為LnLnLn，而青海亞麻籽油中這兩種甘三酯的含量均高于寧夏、內(nèi)蒙古地區(qū)，除了受亞麻籽品種的影響，還可能與海拔、光照、晝夜溫差等氣候條件有關(guān)。

由于含有豐富的α-亞麻酸，亞麻籽油的主要甘三酯組分與其他幾種植物油的差異顯著(P<0.05)。油酸油(菜籽油、花生油、芝麻油)中主要甘三酯為OOO，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總甘三酯的20.57%～40.91%，還含有2個油酸酰基和另一個飽和脂肪酰基的甘三酯，如OOL、POO。亞油酸油(大豆油、葵花籽油、玉米油)中主要甘三酯是LLL、OLL、OOL，這3種甘三酯占總含量的一半以上。不同植物油獨特的甘三酯組成及分布規(guī)律為亞麻籽油的摻假識別提供了可行性。

2.2 亞麻籽油甘三酯指紋圖譜在摻偽識別中的應(yīng)用

2.2.1 青海亞麻籽油甘三酯標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建

對亞麻籽油甘三酯的色譜圖進(jìn)行積分處理后，將色譜信號導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)，設(shè)定S1色譜圖為參照圖譜，采用中位數(shù)法進(jìn)行多點校正、自動譜峰匹配生成對照圖譜。40批亞麻籽油甘三酯色譜圖疊加圖及相應(yīng)的對照指紋圖譜見圖2。共標(biāo)定8個共有峰，由于3號色譜峰OLnLn的保留時間適中、分離度良好、峰面積較大，因此將其作為參照峰記錄各共有峰相對峰面積并進(jìn)行相似度評價。相似度是國家藥典委員會確定的中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)中的一項重要評價指標(biāo)[35]，根據(jù)其規(guī)定，相似度達(dá)到90%以上則認(rèn)為符合該油脂相似度的評定標(biāo)準(zhǔn)[36]，通過夾角余弦法進(jìn)行相似度評價，40批亞麻籽油樣品指紋圖譜相似度均達(dá)到97%以上，說明青海亞麻籽油樣品甘三酯組成具有較好地一致性，故該標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可以全面地表述青海亞麻籽油的甘三酯信息。

注：1～8為不同甘三酯色譜峰，36～48為ECN。圖2 青海亞麻籽油甘三酯成分疊加圖及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

2.2.2 基于指紋圖譜相似度的亞麻籽油摻假鑒別

利用相似度評價系統(tǒng)計算摻偽亞麻籽油與純亞麻籽油的相似度，以摻偽比例為橫坐標(biāo)、對應(yīng)相似度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，樣品摻偽比例越大，其甘三酯圖譜與亞麻籽油對照指紋圖譜相似度越小，6種植物油摻偽模型均呈遞減趨勢，相關(guān)線性方程見表3。利用各摻偽模型的線性方程計算摻偽量，與實際摻假量對比得到相對誤差，結(jié)果見表4。6種植物油摻偽模型中摻假量的相對誤差平均值均小于1%，可以精確檢測摻假。表明當(dāng)摻入植物油比例為10%及以上時，摻偽模型可以對純亞麻籽油與摻偽亞麻籽油進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。

表3 摻偽亞麻籽油摻偽模型曲線方程

表4 摻偽亞麻籽油指紋圖譜相似度及相對誤差

2.3 判別分析識別亞麻籽油中摻偽植物油種類

判別分析是以一批明確分類的樣品建立判別函數(shù)進(jìn)而用此函數(shù)對未知樣品進(jìn)行判別的一種統(tǒng)計方法[37]。將40批純亞麻籽油命名為種類1，編號為YMZ1～YMZ40，摻有不同比例菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油的摻假亞麻籽油分別命名為種類2(C1～C5)、種類3(D1～D5)、種類4(H1～H5)、種類5(K1～K5)、種類6(Y1～Y5)、種類7(Z1～Z5)，利用SPSS 23.0對7類食用油樣品的11個甘三酯指標(biāo)(LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、LLL、OLnO、OLL、OlnP、OOL、OOO、POO)進(jìn)行判別分析，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，判別分析結(jié)果與實際情況基本一致，40批純亞麻籽油與6種摻假亞麻籽油樣品能夠較好地區(qū)分。線性判別方程包括7類食用油及11個指標(biāo)，方程對應(yīng)驗證結(jié)果見表5。40批純亞麻籽油均被正確識別，摻假亞麻籽油中共有5個樣品出現(xiàn)誤判，其中當(dāng)亞麻籽油中摻入菜籽油比例為10%時，被誤判為亞麻籽油中摻入花生油；摻入花生油比例為10%時，被誤判為純亞麻籽油；而葵花籽油、玉米油、芝麻油摻入量為10%時，均被誤判為亞麻籽油中摻入了大豆油；大豆油與亞麻籽油甘三酯液相色譜特征差別較大，對于亞麻籽油摻入大豆油的情況未出現(xiàn)誤判，準(zhǔn)確率達(dá)100%。因此，判別分析模型可以識別摻入比例為10%及以上的大豆油摻假、20%以上的菜籽油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油的摻假，且準(zhǔn)確率達(dá)92.9%，說明根據(jù)甘三酯組成及含量鑒別亞麻籽油摻偽種類是可行的。

表5 不同類型食用油判別分析結(jié)果

圖3 典則判別分析

3 結(jié)論

亞麻籽油各甘三酯組分在試驗條件下得到良好分離，亞麻籽油與用于摻假的6種植物油甘三酯分布情況差異顯著，OLnLn、LnLnLn等以亞麻酸為主的不飽和甘三酯是亞麻籽油的主要甘三酯組分。運用亞麻籽油甘三酯對照指紋圖譜識別摻假亞麻籽油，當(dāng)亞麻籽油中摻入植物油比例達(dá)10%以上時，可以對純亞麻籽油與摻假亞麻籽油準(zhǔn)確判別。采用判別分析識別摻假亞麻籽油中植物油的種類，在本實驗條件下，建立的判別分析模型可以準(zhǔn)確識別出摻假植物油的種類，是一種快速、簡便的亞麻籽油摻偽鑒定方法