同位素內標-高效液相色譜-串聯質譜法同時測定小麥和玉米中19種真菌毒素

何卓霖，李子琨，穆 蕾，謝云峰，王 亮

(新疆大學生命科學與技術學院1，烏魯木齊 830046) (北京工業大學環境與生命學部2，北京 100124) (中糧營養健康研究院；營養健康與食品安全北京市重點實驗室3 ，北京 102209)

真菌毒素是產毒真菌在一定條件下產生的次級代謝產物，能夠引發人和動物產生各種急性或慢性疾病[1-4]。世界衛生組織(WHO)和聯合國糧農組織(FAO)將單端孢霉烯族類毒素、伏馬類毒素、赭曲霉類毒素、黃曲霉類毒素等列為造成食源性疾病的根源之一[5,6]。糧食及其制品在生產、加工和運輸的過程中均有可能受到多種真菌毒素污染[8,9]。據調查，我國小麥和玉米易受脫氧雪腐鐮刀烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏馬毒素(FB)等的污染；朱群英等[10]利用液質聯用同位素內標法測定204份小麥粉樣品中7種真菌毒素，其中DON檢出率達90%，超標率為41%，ZEN檢出率為68.6%，超標率為2.9%；譚莉等[11]利用基質分散固相萃取凈化(QuEChERS)技術結合超高效液相色譜-串聯質譜法測定240份玉米樣品中的9種真菌毒素，DON及其衍生物檢出率為30.4%～52.9%，FB檢出率達85.8%～96.7%；任貝貝等[12]對河北省的74份玉米、玉米制品以及240份小麥樣品中16種真菌毒素污染水平進行調查分析，FB、ZEN和DON為主要污染物。我國高度重視真菌毒素污染問題，頒布了食品中真菌毒素限量標準[13]，對小麥和玉米中黃曲霉毒素B1 、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的含量作了限定，但是尚未明確規定伏馬毒素、T-2毒素和HT-2毒素等毒素限量值。開發快速、精準、高通量的真菌毒素檢測方法對于加強糧食毒素污染監測能力，提升糧食質量安全保障水平，具有重要意義。

目前，常用的真菌毒素檢測方法主要包括酶聯免疫吸附法(ELISA)[14,15]、高效液相色譜法(HPLC)[16-19]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS )[20,21]等。其中ELISA具有方法簡單、樣品處理時間短等優點，多用于單一真菌毒素的快速檢測，但重復性較差且易受到基質的干擾出現假陽性[14]。HPLC法常結合熒光或紫外檢測器，多用于檢測單一或者同一類化學性質相近的同類真菌毒素，但受限于定性能力不足，無法實現多組分真菌毒素同時快速測定[16-18]。LC-MS/MS法具有強大的定性、定量分析能力，適用于多種類真菌毒素同時檢測；其特有的選擇性離子監測技術，極大提高了檢測的靈敏度和特異性，使得樣品可以采用更為簡單、快速的預處理[19-22]，結合同位素內標定量方法能夠校正質譜離子化過程存在的基質效應，保證分析結果的準確性和穩定性[23,24]。

本研究針對常規真菌毒素繁冗復雜的前處理程序，簡化樣品提取凈化方法, 并利用同位素內標校正樣品基質干擾，建立LC-MS/MS法同時測定小麥和玉米中常見19種真菌毒素方法，為糧食中真菌毒素精準檢測、污染監測和風險預警提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

LC-30AD高效液相色譜儀，QTRAP 5500 三重四級桿質譜儀，Allegra 64R臺式高速離心機，TTL-DCⅡ型氮吹儀，Mili Q超純水機，Dragon Lab QL902渦旋振蕩器，SB-3200DTDN 超聲波清洗器。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈，色譜純；甲酸，色譜純；甲酸(98%)；超純水，Mili Q純水機制得；黃曲霉毒素混合標準溶液(AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2)；嘔吐毒素混合標準溶液(DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON)；T-2毒素(T-2)；HT-2毒素(HT-2)；伏馬毒素B1(FB1)；伏馬毒素B2 (FB2)；伏馬毒素B3 (FB3)；赭曲霉毒素A(OTA)；赭曲霉毒素B (OTB)；雜色曲霉毒素(STC)；玉米赤霉烯酮混合標準溶液(玉米赤霉酮(ZAN)、赤霉烯酮(ZEN)、α-赤霉醇(α-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)；13C黃曲霉毒素混合標準液(U-[13C17]-AFTB1、U-[13C17]-AFTB2、U-[13C17]-AFTG1、U-[13C17]-AFTG2)；13C伏馬毒素混合標準液(U-[13C34]-FB1、U-[13C34]-FB2)；U-[13C34]-FB3；U-[13C17]-3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)；U-[13C15]-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)；U-[13C17]-15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；U-[13C18]-玉米赤霉烯酮(ZEN)；U-[13C22]-HT-2毒素；U-[13C20]-赭曲霉毒素A(OTA)；U-[13C24]-T-2毒素(T-2)；U-[13C24-STC]；U-[D4-α-ZEL]

1.3 方法

1.3.1 19種真菌毒素混合標準溶液的配制

分別移取一定體積的19種真菌毒素標準溶液于5 mL容量瓶中，加入適量乙腈∶水(80∶20)溶液定容，配制成19種真菌毒素的混合標準溶液，充分混勻后于-20 ℃以下冰箱內避光保存，質量濃度見表1。

表1 19種真菌毒素混合標準溶液質量濃度

1.3.2 16種真菌毒素穩定同位素內標混合標準溶液的配制

分別移取一定體積的16種真菌毒素同位素標準溶液于1 mL容量瓶中，加入適量乙腈∶水(80∶20)溶液定容，充分混勻后于-20 ℃以下冰箱內避光保存，質量濃度見表2。由于ZAN、α-ZAL、OTB 3種毒素無市售商品化內標物質，因此分別選擇與其結構類似、出峰相鄰的ZEN、α-ZEL、OTA對應的內標13C18-ZEN、D4-α-ZEL、13C20-OTA進行定量。

表2 16種真菌毒素穩定同位素內標混合工作液質量濃度

1.3.3 真菌毒素定量標準曲線工作液的配制

準確吸取2、4、6、8、20、40、80 μL真菌毒素混合標準溶液，均加入10 μL同位素內標混合標準溶液，用甲醇∶水∶甲酸(30∶70∶0.1)溶液稀釋成體積為200 μL的19種真菌毒素定量標準曲線系列工作液。

1.3.4 樣品前處理

取玉米試樣，高速粉碎機粉碎，混勻，準確稱取2 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入50 μL的內標混合工作液，加入10 mL乙腈∶水∶甲酸 (80∶18∶2)溶液提取，渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min，在4 ℃下8 000 r/min離心10 min；將上清液轉移至另一潔凈離心管中，渦旋混勻1 min，取5 mL在40 ℃水浴下氮氣吹干，加入500 μL甲醇∶水∶甲酸(30∶70∶0.1)溶液復溶，渦旋震振1 min，超聲5 min，12 000 r/min離心10 min，取上層清液待測。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Shiseido-C18(100 mm×2.0 mm×3 μm)，進樣量10 μL，流速0.3 mL/min；流動相：A相為0.1%甲酸/水溶液，B相為甲醇溶液，梯度洗脫條件如表3所示。

表3 梯度洗脫程序

1.3.6 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)，離子源溫度：550 ℃；離子噴霧電壓：5 500 V(正模式)/-4 500 V(負模式)；氣簾氣：35 psi；氣體1∶50 psi；氣體2∶55 psi；采用多反應監測(MRM)模式進行檢測，質譜參數見表4。

表4 質譜條件參數

續表4

2 結果與討論

2.1 真菌毒素的分離優化

本研究通過優化液相流動相洗脫梯度、質譜離子源參數以及各真菌毒素的碎裂能和去簇電壓，以期獲得最優的分離效率和檢測靈敏，結合19種真菌毒素的結構性質差異，分別使用正、負離子模式采集，MRM色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 13種真菌毒素混標的正模式MRM色譜圖

圖2 6種真菌毒素混標的負模式MRM色譜圖

2.2 前處理方法優化

為有效避免糧食基質對真菌毒素提取效率的影響，綜合考慮19種真菌毒素的極性差異，分別使用不同有機相比例的提取液進行提取。以玉米基質為例，分別考察使用10 mL乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2的提取液和10 mL乙腈∶甲酸=98∶2提取液提取，本實驗中，應用乙腈∶水 (98∶2) 進行提取時，提取液中高比例的有機溶劑會大量溶出基質中的雜質，造成方法靈敏度降低；其次，大部分毒素的回收率也無法滿足要求。經過優化，使用乙腈∶水∶甲酸(80∶18∶2) 提取液時，非極性較大的毒素如黃曲霉毒素、鐮刀菌屬毒素、赭曲霉毒素等均有較好的提取效率，同時，各真菌毒素的回收率均在60%～120%之間，綜合考慮，選取乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2的提取液可實現19種真菌毒素的統一前處理并保證各毒素目標物回收率均滿足要求。

2.3 基質效應

基質效應主要是由于樣品中的內源性組分以及樣品處理過程中引入的雜質造成的，在電噴霧離子化模式下，各類真菌毒素的質譜響應強度均易受到基質干擾[25,26]，本實驗根據純溶劑標準曲線和空白基質標準曲線的斜率來判斷基質效應的強弱。基質效應按公式計算:C= ( 1-Ss/Sm) ×100%；式中：C為基質效應；Ss為純溶劑標準曲線斜率，Sm為空白基質配制的標準曲線的斜率。|C| 在20% 以下為較弱基質效應，在20%～50%之間為中等基質效應，50%～100%為之間強基質效應[27]。小麥和玉米的基質效應見表5。結果顯示，黃曲霉毒素、嘔吐毒素和伏馬毒素都具有強基質效應，其余的少數真菌毒素屬于較弱基質效應。因此，在所有樣品和標品中均加入穩定同位素，利用同位素內標法定量，從而彌補真菌毒素的基質效應，保證質譜結果的穩定性與準確性。

表5 小麥和玉米的基質效應

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線、檢出限和定量限

以目標分析物面積與對應內標峰面積的比值為縱坐標(Y)、相應目標分析物的質量濃度為橫坐標(X, μg/L)繪制標準曲線，以3倍信噪比和10倍信噪比時對應的目標物峰面積計算濃度，確定方法對于各目標物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結果如表6所示。在質量濃度范圍內19種真菌毒素色譜峰面積與質量濃度成良好線性關系，相關系數R2大于0.992，檢出限(LOD)為0.04～10.00 μg/kg，定量限(LOQ)為0.12～30 μg/kg。

表6 線性方程和檢出限、定量限

2.4.2 回收率和精密度

取空白樣品，分別添加低、中、高3個濃度水平的混合標準溶液，每個加標水平平行測定6次，計算6次加標實驗的平均回收率以及相對標準偏差(RSD)，結果見表7。本方法回收率和精密度結果良好，回收率在61%～117%之間，相對標準偏差(RSD)小于15%，符合GB/T 27404—2008的實驗室質量控制規范要求[28]，方法具有良好的準確和精密度，適用于糧食中19種真菌毒素的日常檢測。

表7 回收率和精密度結果(n=6)

續表7

2.4.3 質控樣品的考察

為了進一步驗證方法的準確性和適用性，使用建立的檢測方法對FAPAS能力測試樣品玉米標準物質(TCL0406QC)進行檢測。如表8所示，10種真菌毒素的檢測值均在范圍內，且接近標示值，表明本實驗所建立的方法準確可靠。

表8 基體標準物質玉米中各真菌毒素檢測結果

2.5 實際樣品測定

應用建立的方法，對來自不同產地的14份小麥和14份玉米樣品進行檢測，結果如表6所示。玉米主要受到嘔吐毒素、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮的污染，其中嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮的檢出率均為86%；我國真菌毒素限量標準GB 2761—2017對谷物及其制品中DON和ZEN的限量為1 000、60μg/kg[12]，而樣品中DON和ZEN的含量為1 870.25、266.75 μg/kg，嚴重超過國家限量標準，超標率均為43%；而小麥中主要污染的毒素為15-AC-DON、DON、FB1，小麥中各真菌毒素均未超過國家限量。為確保糧食質量安全，在糧食種植和生產的過程中進行真菌毒素的監測十分有必要。

表9 小麥、玉米實際樣品檢測結果

3 結論

本研究基于高效液相色譜-串聯質譜技術，結合同位素內標定量，建立了小麥和玉米中19種真菌毒素的精準檢測方法。該方法靈敏度高、前處理簡單、分析速度快。經驗證，準確度和精密度滿足方法學要求，方法定量限遠低于我國國家標準小麥和玉米中真菌毒素最大殘留限量標準，適用于批量糧食樣品中多種類真菌毒素殘留污染的快速篩查和精準定量檢測。