動脈粥樣硬化實驗動物模型及方法的研究進展*

楊定法，趙慶宇婧 綜述，顏紅嬌，趙聲蘭△ 審校

(1.云南中醫藥大學，昆明 650500；2.昆明海關技術中心 650100)

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性血管疾病，是許多心血管病的基礎，例如冠心病、動脈疾病、急性心肌梗死等。2020年中國心血管健康與疾病報告推算中國約3.30億人患心血管病，其患病率一直持續升高，其病死率位列各疾病之首[1]。AS致病因素包括遺傳、年齡、飲食習慣、高血糖、高血脂和高血壓等。2016年中國大約有240萬人死于AS，占心血管疾病死亡人數的61%，占所有死亡人數的25%[2]。2020年在全球30～79歲人群中，約有19.4億人患有不同發展時期的AS病癥，AS已嚴重影響著人類的健康[3]。

AS病變由輕到重有6型：Ⅰ型是最初的病變，動脈內膜適應性增厚，大量脂蛋白誘導內膜巨噬細胞增多并形成充滿脂滴的巨噬泡沫細胞[4-5]。Ⅱ型病變主要包括脂肪條紋，肉眼可見動脈內膜表面的黃色條紋、斑塊或斑點。Ⅲ型病變也稱為中間病變、過渡性病變和AS前病變，在動脈內膜適應性增厚的平滑肌細胞層之間形成脂質池。Ⅳ型病變細胞外脂質積聚形成脂核(脂質核心)，脂質核心引起了嚴重的內膜紊亂，使動脈壁增厚，內膜平滑肌細胞和深層內膜的細胞間基質排列分散等。Ⅴ型病變有明顯的新纖維結締組織形成，中膜平滑肌細胞排列紊亂、數量減少，動脈出現不同程度的狹窄。Ⅵ型病變是復雜病變，在Ⅳ型和Ⅴ型病變的基礎上出現病變斑塊表面的破裂、血腫或出血及血栓沉積等。

目前，構建AS實驗動物模型主要通過高膽固醇、高脂肪飲食誘導形成，但與人體病變相比，并不完全一致。在大多數AS實驗動物模型中，動物并不總是按照預想，發展形成斑塊破裂、心肌梗死和猝死等并發癥[6-7]。理想的AS模型應與人體病變相似，且能應用于相關醫藥研究中。所以構建一種與人類發病機制、臨床表現相似或接近的動物模型是探究AS發病機制和研發有效治療藥物的關鍵。

1 動 物

用作AS模型的動物須易于獲得，能以合理的成本維護，容易處理并具有明確的遺傳特征[8]。此外，動物最好在食用與人類相似的飲食后能自發發生病變。目前，常用于建立AS模型的動物包括大鼠、小鼠、豚鼠、小型豬和家兔等，各有其優缺點，見表1。

表1 幾種常用AS模型動物的比較

1.1大鼠

大鼠長期給予膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶以及高脂肪、高膽固醇的飲食能發展成AS病變，但同時伴有體重明顯減輕和病死率高。建立動物模型通常選擇6～8周齡雄性Wistar或SD大鼠。ZHAO等[9]選用SD大鼠，給予高脂飲食(總膽固醇3.0%，基礎飼料81.3%，豬油10.0%，蔗糖5.0%，丙基硫氧嘧啶0.2%，膽酸鈉0.5%)喂養9周，結合維生素D3建立AS大鼠模型。

1.2小鼠

C57BL/6J純系小鼠能用來構建AS模型，含15%脂肪、1.25%膽固醇、0.5%膽酸的高脂飲食喂養14周會形成高膽固醇血癥和散在的脂肪斑塊等AS病變，但病變較小，沒有進展到纖維斑塊[10]。隨著胚胎操作技術與DNA同源重組技術的成熟與應用，出現了基因改造小鼠。現在普遍認為基因改造小鼠是檢測AS特定基因靶點缺失或過度表達最重要的動物模型，它對研究AS分子機制和有潛在價值的途徑非常重要。目前常用的基因改造小鼠有ApoE-/-小鼠和LDLr-/-小鼠。研究發現普通飼料喂養ApoE-/-小鼠可形成AS斑塊，LDLr-/-小鼠只會出現小病變[11]；高脂飲食誘導，ApoE-/-小鼠比LDLr-/-小鼠病變的速度更快，所以ApoE-/-模型更廣泛用于實驗性AS研究[12]。

1.3豚鼠

豚鼠與人類有許多相似之處，包括擁有多種代謝脂蛋白的酶，脂蛋白代謝與人類類似；顯示出與人類相似的肝膽固醇合成和分解代謝速率；豚鼠和人類在從血漿中清除LDL的機制上具有相似之處等。豚鼠對高膽固醇飲食十分敏感，通常豚鼠攝入高膽固醇飼料一段時間后即可形成早期AS斑塊。

1.4家兔

家兔是AS研究使用較多的動物之一。它的脂蛋白譜與人類相似，表達膽固醇酯轉移蛋白，且吸收外源性膽固醇能力強，容易形成AS病變[13]。構建AS模型兔通常選取3～4月齡的新西蘭大耳白兔或日本大耳白兔，單獨喂食高膽固醇飲食或聯合動脈球囊損傷等方法，誘導主動脈發生粥樣硬化病變[8]。值得注意的是，新西蘭大耳白兔長期高膽固醇喂養易導致高膽固醇血癥，大量炎癥和肝毒性發展，導致脂肪肝和黃疸等。IZIDORO等[14]采用高膽固醇飲食(0.2%)加腹主動脈球囊內皮剝脫術誘導新西蘭白兔，建立實驗性AS模型。

1.5小型豬

小型豬是構建AS動物模型較為理想的動物。從生理、生化及解剖學等角度看，小型豬和人類都很像，其大動脈的解剖結構90%與人相同，低密度脂蛋白結構和載脂蛋白等與人類似。由于上述相似性，小型豬AS模型可作為架橋工具，將從大鼠、小鼠等其他小動物模型研究中獲得的知識轉化為人類AS藥物的開發[15]。ZHAO等[16]通過給予近交系五指山小型豬高膽固醇高脂飲食，檢測發現6個月腹主動脈和髂動脈出現斑塊病變，8個月冠狀動脈出現斑塊病變，12個月所有的主要動脈都發現AS病變，最嚴重的部位出現了脂核、膽固醇沉淀和鈣沉積。

利用CNKI數據庫，以AS模型為主題檢索2010-2020年的相關文獻，然后再分別以大鼠、小鼠、豚鼠、兔、小型豬為主題在結果中檢索。使用大鼠和小鼠建立AS模型的相關文獻較多，且越來越多的研究者選擇ApoE-/-小鼠；使用小型豬和豚鼠的相對較少。

2 高脂飼料誘導

AS的表征之一是血脂質積聚，是動物長期食用高膽固醇、高脂飲食的結果。高脂飼料配方依據模型動物、造模方法、實驗目的和條件的差異而定，通常是普通飼料加適量的膽固醇、豬油、白糖、蛋黃粉等組成。豬油可使飼料更好成形，白糖可以改善高脂飼料的口感，增加動物的食欲。值得注意的是大鼠和C57BL/6J純系小鼠具有抗AS的特性，在選取它們建立模型時，高脂飼料中需添加丙基硫氧嘧啶和膽酸鈉[17]。丙基硫氧嘧啶能抑制甲狀腺功能、降低膽固醇代謝；膽酸鈉可提高腸道對脂肪和膽固醇的吸收[18]。

高脂飼料誘導操作簡便、成本低，且符合人類飲食的特點，但建模周期長，模型不易成功，較難發展為晚期AS病變。以高脂喂養作為基礎，再聯合腹腔維生素D3、免疫炎癥誘導、機械損傷和基因改造等方法，可較好建立AS晚期動物模型。但高脂飼料不同配方對血脂TG、TC和LDL-C等指標的影響有一定差異(表2)。

表2 幾種高脂飼料配方及喂食相應飼料后不同動物模型血脂指標變化率

3 高脂飼料結合維生素D3誘導

此方法主要用于構建AS大鼠模型。維生素D3是鈣離子誘導劑，可誘發血管鈣化，升高血液中血鈣水平，損壞動脈壁，加快AS病變。大鼠無膽囊，脂質吸收率低，僅靠高脂飼料很難形成AS病變，高脂飼料誘導的同時給予維生素D3，能有效提高模型成功率。LIAN等[25]高脂飲食誘導的同時單次腹腔注射維生素D3，12周后大鼠形成了明顯AS病變。但該方法維生素D3的給藥劑量需嚴格控制，劑量過低或過高都影響模型的建立。目前不同研究者維生素D3給藥劑量和頻率有一定差異(表3)。

表3 維生素D3的幾種給藥劑量和給藥方式

4 免疫炎癥誘導

AS是一種慢性炎癥性的血管病變。炎性反應貫穿了AS的所有階段：從內膜中的脂質蓄積到斑塊形成和最終破裂。細胞炎性因子的表達增加，炎性細胞的形成等都促進了AS的發生與發展。炎癥誘導方法通過給予牛血清白蛋白、肺炎衣原體和幽門螺桿菌等形成免疫刺激，誘發免疫炎性反應。

4.1病原體誘導法

病原體感染與AS病變密切相關。用于AS模型研究的病原體有幽門螺桿菌和肺炎衣原體等。幽門螺桿菌感染能讓巨噬細胞、中性粒細胞、T細胞和B細胞等聚集，提高C-反應蛋白、 IL-6、IL-8和TNF-α等的水平，誘導動脈發生局部炎性反應，內皮細胞鈣離子濃度升高，加速AS發展。肺炎衣原體會與血管細胞相互作用產生氧化應激，進一步促進泡沫細胞的形成，并通過刺激血小板活化和VSMC增殖、遷移等促進AS病變的形成。陶珍等[30]采用雄性新西蘭兔在喂食高脂飼料(1%膽固醇、15%鮮蛋黃、5%豬油、79%基礎飼料)的基礎上，經耳緣靜脈注射幽門螺旋桿菌，成功建立兔AS模型。

4.2牛血清白蛋白法

唐曦等[31]比較兩種方式(僅給予高脂飼料：88.5%普通飼料、7.5%蛋黃粉、6%膽固醇、4%豬油；給予相同高脂飼料的同時，每周肌內注射250 mg/kg胎牛血清白蛋白)構建新西蘭大白兔AS模型，發現高脂飼料復合免疫損傷家兔血脂水平更高，粥樣斑塊病變更嚴重。劉劍剛等[32]用日本大耳白兔喂食高脂飼料，同時給予250 mg/kg牛血清白蛋白，15 d后再次給予250 mg/kg牛血清白蛋白，72 d后可以觀察到兔主動脈有斑塊形成，血脂水平顯著增高。

5 機械損傷誘導

脂質沉積與內皮損傷是AS病變的兩大基本因素。當內皮細胞損傷時，動脈內膜的完整性、通透性發生改變，脂質積聚在受損內膜處，形成泡沫細胞并不斷積累構成脂肪斑塊，進而形成AS斑塊。內皮損傷包括直接損傷和間接損傷。

5.1球囊損傷法

該方法是通過球囊的膨脹和拖拉直接造成動脈內皮損傷和脫落。YANG等[33]采用反復球囊損傷腹主動脈，結合高脂飼料的方法成功建立兔主動脈粥樣硬化斑塊模型。張莉等[34]采用球囊損傷術加高脂飼料(1%膽固醇、15%豬油、15%花生油、20%蛋黃粉、1%食鹽、48%普通飼料)連續飼喂小型豬12周后，頸總動脈血管內膜增厚，內膜及中膜均有泡沫細胞，動脈壁上有不同程度的鈣化斑塊形成等。

5.2動脈鉗夾術

該方法是物理阻斷動脈的正常供血，間接造成頸動脈內膜損傷，促進AS斑塊的形成。王慶林等[35]給予大鼠高脂飲食 (10%蛋黃、8%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽鹽、4.8%食鹽)，并進行頸動脈鉗夾操作，6周后觀察到AS病變。李土明等[36]給予Wistar大鼠高脂飲食和腹腔注射維生素D3的同時進行頸總動脈鉗夾手術，構建了頸總動脈粥樣硬化大鼠模型。

6 基因改造動物模型

轉基因動物是指把外源基因穩定整合在動物染色體基因組內，并且能遺傳給后代的一類動物。大量研究表明，ApoE敲除鼠和LDL受體基因敲除鼠動脈可發生明顯的AS病變，且具有人類粥樣斑塊的典型特征，是研究AS最重要、最常用、最經典的轉基因動物模型。近年超過95%的AS研究都是基于載脂蛋白E缺乏或低密度脂蛋白受體缺乏的動物[37]。

6.1ApoE基因敲除小鼠模型

ApoE是一種糖蛋白，主要在肝臟和大腦中合成，是除低密度脂蛋白外所有脂蛋白顆粒的結構成分。它在脂蛋白代謝中發揮重要作用，還能抑制脂蛋白氧化，減少OxLDL等形成，減少泡沫細胞的形成[38]。1992年PIEDRAHITA等通過胚胎干細胞的同源重組技術成功地復制出ApoE基因敲除小鼠，以基因為靶點的小鼠模型改變了AS研究的面貌，形成了新的AS理論[39]。ApoE-/-小鼠清除血漿脂蛋白的能力嚴重受損，在正常飲食下，乳糜粒殘留物、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白膽固醇含量明顯升高，血漿總膽固醇濃度達3～5 mg/mL。此外，缺乏ApoE會增加對飲食脂肪和膽固醇的敏感性，喂食高膽固醇、高脂肪飲食后，血漿膽固醇水平會進一步升高，加速AS病變的進程[40]。

6.2LDL-R基因敲除小鼠模型

LDL受體是一種膜受體，通過介導富含膽固醇的LDL的胞吞作用來維持血漿LDL水平，還參與相關脂蛋白內化和代謝。1993年ISHIBASHI等以基因打靶技術成功培養LDL-R基因敲除小鼠，其血漿中脂蛋白增多，血膽固醇水平升高，易形成AS病變。該模型的特點有：首先，血漿膽固醇主要由LDL顆粒攜帶，脂質分布和人類更相似。其次，由于缺乏功能性LDL受體，LDLr-/-小鼠模型能觀察到在人類家族性高膽固醇血癥中出現的特征。最后，與ApoE缺乏癥相比，LDL受體的缺乏對炎癥沒有影響。因此，該小鼠模型中的AS斑塊形成主要是基于血漿脂質水平升高，而與炎癥和LDL受體相關的其他功能無關。

6.3其他轉基因動物模型

ApoE/LDL受體雙敲除小鼠是一種可自發形成AS病變的動物模型，在規律飲食的情況下，病變情況比ApoE-/-小鼠或LDLr-/-小鼠都更嚴重。ApoE3-leiden小鼠能表達可檢測的內源性ApoE水平，這為研究升高的血脂質水平而不干擾炎癥過程提供了可能性[41]，當喂食高膽固醇、高脂飲食時，血漿總膽固醇和甘油三酯水平大幅升高，形成晚期AS病變。ApoE-/-兔在正常飲食中表現出輕度高脂血癥，對膽固醇飲食誘導的AS高度敏感[42]。此外，國內外研究者還建立了PCSK9-AAV小鼠、ApoE-/-小型豬、ApoE-/-大鼠、LDLr-/-大鼠、LDLr-/-兔等多種AS轉基因動物模型。

簡而言之，人們做出了許多研究來建立盡可能類似于人的AS動物模型，然而當前的每種動物模型都有其優點和局限性，人們通常只能根據實驗需求和條件選擇合適的模型。建立自發性(即沒有機械干預)斑塊破裂、盡可能具有類似于人的AS病變進程，最終能發展形成卒中、猝死或心肌梗死等的動物模型仍需進一步研究。