牦牛血清對H9c2細胞增殖及衰老的影響*

白玉婷，格日力，王立生，蘇曉靈△

(1.青海省人民醫院心血管內科，西寧 810001；2.青海大學醫學院高原醫學研究中心，西寧 810001；3.青島大學附屬醫院醫學研究中心分子診斷與再生醫學科，山東青島 266000)

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)是一種廣泛用于非計數型原代細胞和永生化細胞培養的具有代表性的添加劑。FBS的精確組成成分尚不清楚，因為這種添加劑包含各種未知的天然小分子和比例不同的蛋白質(批次之間成分變化)。牦牛是一種生存于海拔3 500 m以上的野生牛種，是青藏高原及中國周邊地區的標志[1]。牦?？梢猿浞掷闷渌箅y以利用的高山草原，并為高海拔居民提供了必要的資源，是高海拔居民生存的手段[2]。牦牛與低海拔牛在解剖學和生理學方面有許多不同之處，除通過消除低氧導致的血管收縮而生活在高海拔地區外[3]，其心肺增大、缺氧性肺血管收縮不足、覓食能力增強、能量代謝增加使其能更好適應高海拔地區。牦牛作為理解適應的分子基礎模型動物，其最小生物信息學在整個基因組測序之前便已完成[4]，但牦牛的非正常存活生物學機制及其對高原氧化應激的反應機制目前尚不清楚[5],其對細胞的增殖及衰老有何影響至今少見相關文獻報道。本研究通過與其他品種FBS進行比較，研究了牦牛血清對胚胎大鼠心肌細胞(H9c2細胞)生長、增殖及衰老的影響，以期找到H9c2細胞生長更相適應的血清。

1 材料與方法

1.1材料

H9c2由中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所傳代保存。試劑為杜氏改良Eagle培養基(DMEM)培養液、二甲亞砜、CCK8試劑、血清(四季青、Hyclone)等。

1.2方法

1.2.1H9c2細胞培養

使用含10%牦牛血清、Hyclone血清、四季青血清加DMEM培養液培養H9c2細胞，置于37 ℃、5% CO2的培養箱，每2天更換1次培養基，待細胞長至對數生長期時進行試驗。

1.2.2牦牛血清的制備

取靜脈血，室溫下靜置1 h，2 500 r/min離心15 min，分離血清，并經0.22 μm濾膜濾過，30 min水浴滅活。

1.2.3細胞計數法

取待測細胞和對照細胞懸液各10 μL，滴于細胞計數板上，在低倍鏡下計數4個大方格內的細胞。邊緣壓線細胞以數上不數下，數左不數右的原則進行。

1.2.4H9c2細胞增殖檢測

將H9c2細胞以5×103細胞/mL密度(100 μL)接種于96孔板中，每組5個復孔，37 ℃、5% CO2培養箱培養24、48、72 h。培養結束前每孔加入10 μL CCK8，37 ℃避光孵育2 h后用酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定吸光度(A)值。

1.2.5q-PCR測定

用Trizol法提取總RNA，逆轉錄獲取cDNA，配置好q-PCR反應液后以4副孔加樣，瞬時離心去氣泡后采用ABI 7500 FAST q-PCR儀進行標準PCR擴增程序：50 ℃ 20 s，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。

1.3統計學處理

2 結 果

2.1不同血清對H9c2細胞生長的影響

牦牛血清培養細胞的細胞數在第2～6天均顯著高于四季青血清，在第2天顯著高于Hyclone血清，差異均有統計學意義(P<0.05)；其他時間點比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；Hyclone血清培養細胞的細胞數在第3、4、5、6天均顯著高于四季青血清，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 3種血清對H9c2細胞生長的影響

2.2不同血清對H9c2細胞增殖的影響

牦牛血清培養細胞的細胞倍增數在第24、48、72、96、120小時均顯著高于Hyclone血清和四季青血清，Hyclone血清培養細胞的細胞倍增數在第24小時顯著高于四季青血清(P<0.05)，其余時間點比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 3種血清對H9c2細胞增殖的影響

2.3不同血清對H9c2細胞p21、p16、p38、p53表達的影響

四季青血清p21、p53表達均顯著高于牦牛血清和Hyclone血清，差異均有統計學意義(P<0.05)。3種血清p16、p38 mRNA表達比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 3種血清對H9c2細胞p21、p16、p38、p53表達的影響

3 討 論

血清是從牛胎血液中所獲得的體外培養基的常見補充物，包含生長因子、激素、維生素、氨基酸、脂肪酸和細胞生長所需的微量元素，因此，早期即被引入細胞生物學研究中[6]。血清作為真核細胞體外培養的補充物，在心肌細胞生長、繁殖過程中發揮著重要作用。不同血清對心肌細胞的生長影響不同，因此，找到與H9c2細胞生長相適應的血清顯得尤為重要。

牦牛能很好地適應高寒草原環境，在空氣稀薄、溫度低、紫外線強、草短等惡劣高原環境下自由生活和繁殖[7]。據文獻報道，牦牛血中的低聚肽抗氧化能力及脂質過氧化抑制能力均顯著優于商品化大豆低聚肽，且牦牛血低聚肽還可緩解缺氧導致的機體應激損傷，具有潛在藥用價值[8]。但在以往，牦牛血未能得到良好的利用及研究，本研究通過比較3種不同品種FBS對H9c2細胞生長及增殖發現，H9c2細胞在含有牦牛血清的培養基中生長狀態良好，細胞活力好，增殖倍數優于Hyclone血清和四季青血清，提示與Hyclone血清和四季青血清比較，H9c2細胞可能更適應于在牦牛血清中生長。

衰老是細胞、組織和器官結構和功能漸進性惡化的生物過程，細胞衰老的典型特征是不可逆的細胞周期阻滯，可能由DNA損傷、氧化應激、營養剝奪、致癌損傷或化療毒性引起[9]。目前有研究表明，細胞衰老具有兩面性，一方面在衰老過程中衰老細胞在各種組織中積累，導致發生許多與年齡相關的疾病，如動脈粥樣硬化、癌癥、肝脂肪變性、阿爾茨海默病、纖維化肺病和骨關節炎[9-12]，而消除這些衰老細胞可以延長壽命[13]。另一方面衰老細胞在胚胎發育、腫瘤抑制、傷口愈合和組織修復等過程中發揮著多種有益作用[14]。細胞增殖和衰老是一個復雜的過程，涉及多種細胞成分和信號通路，其中p21、p53腫瘤抑制基因家族是與衰老相關的最具特征性的因素[15]，而p16是由大多數衰老細胞表達的用于鑒定衰老的關鍵標記物[16]。p38作為一種有絲分裂原激活的蛋白激酶，可被外界信號和炎性細胞因子激活，參與細胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡等多種細胞生物學過程[17]。因此，本研究通過檢測上述指標發現，與牦牛血清和Hyclone血清比較，四季青血清H9c2細胞p21、p53表達最高，而p38、p16表達無明顯差異，提示p21、p53過度表達可能導致H9c2細胞衰老進而影響H9c2細胞的生長和增殖。而LPEZ-OTN等[18]和MUNOZ-ESPIN等[19]研究也表明，在衰老細胞中不可逆細胞周期阻滯主要是由細胞周期抑制劑——p16、p21、p53上調所致。然而，牦牛血清與其他血清的不同之處及其如何影響細胞生長、增殖及衰老尚需進一步深入研究。