平胃散加味對非酒精性脂肪肝大鼠炎癥介質及氧化應激的影響研究

梁金成 譚文惠 謝梅娟 陳茹琴 徐國良

(1 廣東省第二人民醫院,廣州,510000; 2 佛山市中醫院高明醫院,佛山,528500)

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是一種代謝應激性疾病,其發病率隨著人們飲食習慣、生活方式的改變及經濟的發展呈不斷上升趨勢,嚴重影響人們的生命質量[1-3]。現代醫學對于NAFLD的治療主要集中在改善胰島素抵抗、降脂、護肝、抗氧化等方面,再加上飲食調養、運動療法等,但藥物治療尚存在一定的問題,如部分降脂藥會損害肝功能或誘發其他不良反應[4-5]。而中醫在NAFLD的治療上存在較大優勢,擁有廣闊的發展前景,因而受到國內外廣大學者的關注[6-8]。本研究探討平胃散加味對NAFLD大鼠肝細胞凋亡、炎癥介質及氧化應激的影響,旨在為治療NAFLD提供參考。現將實驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取48只6周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級健康SD大鼠,體質量(220±20) g,適應性飼養5～7 d,濕度22～25 ℃,濕度50%～60%,自由進食、飲水,自然晝夜交替。大鼠購自廣東省醫學實驗動物中心,許可證號SCXK(粵)2008-0002。動物實驗通過廣州中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查(倫理審批號:20200731001)。

1.1.2 藥物 平胃散加味:厚樸6 g、陳皮6 g、蒼術6 g、甘草1.5 g、桃仁3 g、黃連3 g、姜黃6 g、丹參3 g、膽南星3 g、法半夏3 g,藥材來自于廣州致信藥業有限公司(批號依次為200901、200502、201001、201202、201102、200801、210101、200902、201207、200601)。藥材經冷水浸泡120 min,水煎,分2次,第1次90 min,第2次60 min,取2次水煎液混合并過濾,將其經水浴蒸發濃縮成含生藥1.26 g/mL的濃縮藥液。

1.1.3 試劑與儀器 谷草轉氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)試劑盒(批號:1907211)、丙轉氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)試劑盒(批號:1904082)、白細胞介素-2(IL-2)試劑盒(批號:1902071)、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒(批號:1908172)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(批號:1905281)購于上海晶抗生物工程有限公司,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(批號:1907171)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)試劑盒(批號:1910021)購于上海雅吉生物科技有限公司。全自動生化分析儀(日立公司,日本,型號:AQT90);Beckman imark酶標儀(Bio-rad伯樂,美國,型號:1681130A)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將48只大鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量組和高劑量組,每組12只。除對照組大鼠給予正常飼料外,其余各組大鼠給予OpenSource DietsTM高脂飼料12周制備非酒精性脂肪肝大鼠模型。

1.2.2 給藥方法 各組大鼠根據10 mL/kg給藥,對照組和模型組大鼠給予等劑量生理鹽水灌胃,低劑量大鼠給予1.89 g生藥/kg灌胃,高劑量大鼠給予7.56 g生藥/kg灌胃,1次/d,連續灌胃8周。

1.2.3 檢測指標與方法 于第8周末各組大鼠禁食12 h,稱取大鼠體質量,給予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,于大鼠心臟采血,采集心臟血以4 000×g離心8 min后取血清,放置于-80 ℃下保存待測。將大鼠肝臟組織摘除,稱量肝臟濕重。1)肝細胞凋亡觀察:采用肝臟指數評價肝細胞凋亡,肝臟指數計算參照相關標準[2],指數越高肝細胞凋亡越明顯。2)肝功能水平和氧化應激測定:取上述血清標本,采用全自動生化分析儀測定血清GOT、GPT、MDA和SOD水平,依據試劑盒說明書操作。3)炎癥介質測定:取上述血清標本,采用酶聯免疫吸附試驗法測定IL-2、IL-6和TNF-α水平,依據試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織病理學的影響 對照組大鼠肝臟質地柔軟,表面光滑;模型組大鼠肝臟體積增大,質地較韌,光鏡下肝細胞呈不規則排列,且存在大量脂肪空白細胞,膽管匯管區有大量炎癥細胞浸潤;低劑量組和高劑量組肝臟色澤、體積和質地均有改善,脂肪空泡少見,未見大量炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學改變(HE染色,×200)

2.2 各組大鼠肝臟指數比較 模型組、低劑量組和高劑量組肝臟指數高于對照組(P<0.05);低劑量組和高劑量組肝臟指數低于模型組,且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肝臟指數比較

2.3 各組大鼠肝功能比較 模型組、低劑量組和高劑量組血清GOT和GPT水平高于對照組(P<0.05);低劑量組和高劑量組血清GOT和GPT水平低于模型組,且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝功能比較

2.4 各組大鼠炎癥介質比較 模型組、低劑量組和高劑量組血清IL-2、IL-6和TNF-α水平高于對照組(均P<0.05);低劑量組和高劑量組血清IL-2、IL-6和TNF-α水平低于模型組,且高劑量組低于低劑量組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠炎癥介質比較

2.5 各組大鼠氧化應激比較 模型組、低劑量組和高劑量組血清MDA水平高于對照組,而SOD水平低于對照組(P<0.05);低劑量組和高劑量組血清MDA水平低于模型組,而SOD水平高于模型組(P<0.05);高劑量組血清MDA水平低于低劑量組,而SOD水平高于低劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠氧化應激比較

3 討論

NAFLD是常見的一種慢性肝病,目前認為是與遺傳易感和胰島素抵抗關系緊密的代謝應激性肝臟損傷,而炎癥反應和氧化應激在NAFLD發生、發展中具有重要作用[9-12]。中醫學中并無脂肪肝相關描述,與之相關的記載可見于《黃帝內經》對肥氣的描述。中醫學認為,飲食不節、痰濕體質、情志失調、勞逸失度等因素均可導致脾虛濕蘊、痰濁聚肝,進而導致脂肪肝的形成[13-14]。中醫理論認為,脾臟功能失調是脂肪肝形成的病理基礎,脾主運化,主收納腐熟水谷、運化精微[15]。《素問·經脈別論篇》曰:“飲于入胃,游溢精氣,上輸于脾,脾氣散精,上歸于肺,通調水道,下輸膀胱,水精四布,五經并行。”可見,脾在氣血津液輸布代謝中的重要作用。同時,脾為后天之本,氣血生化之源,若脾失健運,則導致水谷精微運化障礙,表現為水腫、眩暈、氣血衰少、消瘦等脾虛濕困癥狀[16-17]。平胃散加味方出自《名醫類案正續編》,該方由厚樸、陳皮、蒼術、甘草、桃仁、黃連、姜黃、丹參、膽南星、法半夏共同組成。其中厚樸、陳皮、蒼術、甘草具有燥濕運脾、行氣和胃的功效;黃連具有清熱燥濕的功效;膽南星、法半夏具有燥濕化痰的功效;丹參、姜黃具有活血化瘀的功效。縱觀全方可奏燥濕運脾、行氣和胃、化瘀之功。本研究發現,低劑量組和高劑量組肝臟指數低于模型組,由此可見平胃散加味可緩輕肝細胞凋亡。

GOT和GPT是肝功能的重要評價指標,其中GOT能夠判斷肝損害程度,而GPT可反映肝臟病理改變程度。本研究發現,低劑量組和高劑量組血清GOT和GPT水平低于模型組,由此可見平胃散加味可明顯減輕肝細胞受損和脂肪變程度,能夠有效保肝降酶,從而改善肝功能。研究證實,NAFLD與肝臟中炎癥介質有關,炎癥介質通過刺激肝臟發生炎癥反應,誘導肝纖維化并導致肝細胞壞死、凋亡,在NAFLD的發生、發展中具有重要作用[18]。IL-2不僅可促進活化B細胞增殖,且可誘導產生TNF-α等細胞因子[19]。炎癥介質IL-6與肝臟局部炎癥反應有關,不僅能夠抑制脂蛋白脂酶的活性,且可抑制脂肪分解,從而促進脂肪肝形成[20]。炎癥介質TNF-α是由于各種原因造成肝臟損傷過程中最早出現的一種細胞因子,不僅參與多種炎癥反應和免疫反應,同時還可導致其他細胞因子的釋放[21]。SOD作為保護機體免受脂質過氧化損害的一種抗氧化劑,可清除脂質過氧化物和自由基,從而阻斷和減輕脂質過氧化作用[22]。MDA作為脂質過氧化的一種最終產物,可引起細胞壞死、腫脹,導致細胞膜結構嚴重破壞,其水平變化可作為脂質過氧化損傷程度判斷的一種指標[23]。

綜上所述,平胃散加味可減輕NAFLD大鼠肝細胞凋亡,減輕肝臟炎癥反應并調節肝臟氧化應激。但本研究還存在一些不足,納入大鼠較小,還需增加大鼠數量,深入進行多中心、多樣本研究,以提高可靠的參考依據。