基于網絡藥理學探討丹參飲治療心絞痛的作用機制

李 瑩 郭經奇 趙立群

(1 山東中醫藥大學,濟南,250014; 2 山東中醫藥大學附屬醫院老年醫學科,濟南,250014)

心絞痛是心血管內科常見病變,多發生于中老年人,主要由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成,致使血管管腔狹窄、堵塞，或者勞動、情緒激動、寒冷刺激等引起冠狀動脈痙攣,導致心肌急性、暫時性缺血缺氧,以發作性心前區疼痛或胸部不適為典型臨床表現[1-2]。中醫將其歸為胸痹心痛范疇,其主要病機為氣滯、血瘀。中醫運用辨證論治和整體觀念,對于心絞痛的治療有著明顯優勢。丹參飲由丹參、檀香、砂仁三味中草藥組成,首見于《時方歌括》卷下,其上記載丹參飲具有治療心痛、胃脘痛的功效[3]。現代藥理學研究證明,丹參飲對于治療心絞痛等心血管疾病有明確療效,其可通過降低血脂水平、影響細胞凋亡的相關基因表達以及抑制血小板聚集等以改善微循環、治療心肌缺血[4-8]。

較西藥治療而言,中藥復方的多成分、多靶點、多通路的特點,在心絞痛的治療上有一定的優勢,但中藥復方制劑的實驗研究多來自于動物實驗,其作用于人體的物質基礎及機制尚不完全明確。網絡藥理學可通過多種數據庫進行網絡分析,通過建立可視化網絡關系圖,對藥物活性成分、作用靶點以及疾病的靶點蛋白進行分析,預測其作用機制,以填補現代藥理學研究的不足之處[9]。因此,本研究通過網絡藥理學方法,構建丹參飲成分-靶點-疾病網絡進行分析,以探究其物質基礎、作用機制為中醫藥的發展、臨床應用及藥理學研究提供新的思路及依據。

1 資料與方法

1.1 丹參飲活性成分的收集篩選 通過檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)以得到丹參飲中丹參、檀香、砂仁的所有活性成分,將口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)設為>30%,類藥性(Drug Likeness,DL)設為>0.18以篩選及統計出丹參飲的主要活性成分。

1.2 丹參飲主要靶點的篩選 再次應用TCMSP檢索丹參飲的相關作用靶點,并通過UniProt數據庫(http//www.uniprot org/)對其作用靶點進行標準化處理,得到其官方名稱(Official Symbol),并建立數據集。

1.3 心絞痛的靶點篩選 通過GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)以“Angina Pectoris”為關鍵詞進行檢索,得到心絞痛的疾病相關靶點,再將結果導入到Excel表格中進行整理篩選。

1.4 成分-靶點-疾病網絡的建立 為將丹參飲對心絞痛疾病的作用機制闡述地更加明確、具體,把得到的丹參飲的相關靶點與心絞痛的疾病靶點取交集,并利用R 3.6.2軟件繪制韋恩圖。將韋恩圖中所示的交集靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件中,獲得成分-靶點-疾病網絡圖。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡的建立 將取得的交集靶點輸入用于揭示蛋白質之間和預測PPI的STRING數據庫(http://string-db.org/)[10],物種設定為“Homo Sapiens”,隱藏在網絡中出現的斷開的節點,將最低互作分數設為0.4,構建靶點蛋白可視化互作網絡并導出。

1.6 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 通過Bioconductor數據庫(http://www.bioconductor.org/)及R軟件將篩選出的關鍵靶點基因的轉化為基因ID,進行GO功能分析及KEGG通路富集分析,以明確丹參飲治療心絞痛的生物過程及信號通路,并繪制通路網絡圖。

2 結果

2.1 丹參飲中藥物活性成分及靶點篩選結果 檢索出丹參飲的所有化學成分,包括丹參202個,檀香70個,砂仁165個,再根據OB>30%,DL>0.18,共篩選出丹參飲中藥物的活性成分78個,其中丹參65個,檀香3個,砂仁10個。

2.2 藥物-疾病有效成分靶點篩選結果 得到有效成分靶點120個。得到心絞痛的疾病靶點2 578個,利用R X64 3.6.2軟件將其與藥物的靶點取交集,建立藥物-疾病數據集。見表2。得到共同靶點基因93個,相對應的活性成分59個。見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點韋恩圖(藥物與疾病有93個共同靶點)

表1 藥物-疾病有效靶點

2.3 活性成分-靶點-疾病網絡的構建 活性成分-靶點-疾病網絡由154個節點,682條邊組成。見圖2。

圖2 活性成分-靶點-疾病網絡

2.4 PPI網絡構建 93個有效靶點可視化PPI網絡見圖3。其中篩選出鏈接節點最多的20個靶點基因。見圖4。

圖3 PPI網絡

圖4 PPI網絡中20個核心基因

2.5 GO功能分析及KEGG分析結果 得到主要GO條目20個。見圖5。根據分析結果可知,丹參飲對心絞痛疾病的有效靶點基因主要涉及腎上腺素能受體活性(Adrenergic Receptor Activity)、G蛋白偶聯胺受體活性(G Protein-Coupled Amine Receptor Activity)、泛素-蛋白連接酶結合(Ubiquitin-Protein Ligase Binding)、細胞因子受體結合(Cytokine Receptor Binding)、核受體活性(Nuclear Receptor Activity)等功能起作用。

圖5 GO功能分析條目

KEGG通路富集結果顯示147條通路,主要包括前列腺癌(Prostate Cancer)、內分泌抵抗(Endocrine Resistance)、乙型肝炎(Hepatitis B)、膀胱癌(Bladder Cancer)等疾病通路,以及IL-17信號通路(IL-17 Signaling Pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 Signaling Pathway)、TNF信號通路(TNF Signaling Pathway)等主要通路。見圖6～7。

圖6 KEGG主要通路氣泡圖

圖7 KEGG通路示意圖

3 討論

心絞痛疾病隨著老齡化社會的加重,發病率逐年增長,其發病原因復雜,本研究通過網絡藥理學方法研究丹參飲治療心絞痛的作用機制,區別于單純的西藥治療的單一分子、單一通路模式,建立活性成分-靶點-疾病網絡圖,體現中藥復方制劑治療疾病多成分、多靶點、多途徑的優勢。

通過TCMSP篩選出丹參飲中有效成分59個,作用于心絞痛疾病的有效靶點93個。其中作用靶點較多的3個活性成分分別是木犀草素(Luteolin)、丹參酮Iia(Tanshinone Iia)、豆甾醇(Stigmasterol)。經體外實驗研究表明木犀草素可通過提高分解脂質酶的活性以顯著降低大鼠的血脂水平[11],還可通過調節炎癥介質IL-1β,IL-2等細胞因子,抑制炎癥反應,改變部分信號通路、減少細胞內活性氧的產生等發揮抗炎、抗氧化的作用[12]。丹參酮ⅡA具有抗心肌缺血、減輕動脈粥樣硬化以及舒張血管的作用,實驗研究發現丹參酮ⅡA可抑制新西蘭白兔動脈粥樣硬化斑塊的形成并增加其穩定性以防破裂[13-15]。豆甾醇具有抗氧化、抗炎癥反應及降低膽固醇的作用,能有效地降低人結腸癌上皮細胞對膽固醇的吸收[16-19]。

本研究通過活性成分-靶點-疾病網絡圖、韋恩圖以及PPI網絡圖得到丹參飲治療心絞痛疾病的主要靶點93個,AKT1、IL6、FOS、VEGFA、CASP3為其中重要的5個靶點蛋白。王靜等[20]通過大鼠實驗,采用TUNEL法檢測發現轉染AKT1基因會抑制心肌細胞的凋亡,其保護心肌細胞的機制可能與抑制Cyt-C的釋放,保護心肌線粒體有關。IL6作為一種炎癥介質可能通過促進脂質的沉積、血栓的形成、血管平滑肌的增生、血管內皮的損傷等多種途徑參與冠狀動脈粥樣硬化的形成與進展[21]。FOS除了與癌癥相關,還參與了心肌纖維化的發生和發展,楊潔等[22]研究發現,miR-29c過表達可顯著促進小鼠心肌細胞的增值和抑制心肌纖維化,而FOS的過表達則會逆轉此作用,因此FOS與心肌細胞的凋亡與心肌纖維化密切相關。VEGFA能促進血管內皮細胞增殖,可能促進冠脈側支循環的形成,李瑩鴻等[23]通過臨床研究發現,通陽寬胸顆粒能改善穩定型心絞痛患者癥狀,且使VEGFA表達水平升高。既往研究表明冠心病心絞痛患者胱天蛋白酶-3的表達顯著提高,徐興偉等[24]證實,姜黃素膠囊對心絞痛有較好療效,且能明顯降低血清中胱天蛋白酶-3的表達。綜上看來,丹參飲通過影響多種蛋白的表達來治療心絞痛。

通過GO功能分析表明,丹參飲的主要藥物丹參、檀香、砂仁作用于疾病心絞痛的靶點主要參與腎上腺素能受體活性、G蛋白偶聯胺受體活性、泛樣-蛋白連接酶結合、類固醇激素受體活性、細胞因子受體結合、酰胺結合、內肽酶活性等生物過程起作用。

KEGG富集分析主要涉及前列腺癌、內分泌抵抗、乙型肝炎等疾病通路,IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。白細胞介素-17是一個重要的促炎癥介質,主要由Th17分泌,IL-17信號通路既可以促進中性粒細胞、單核細胞等炎癥反應細胞的聚集,又能通過TRAF6激活下游核因子κB通路促進炎癥反應[25]。王俊巖等[26]實驗發現動脈粥樣硬化小鼠的主動脈組織中HIF-1αmRNA表達水平顯著提高,因此抑制HIF-1信號通路的激活能有消抗動脈粥樣硬化。TNF信號通路的激活,也能激活下游核因子κB通路,促進TNF-α、IL-6等炎癥介質的釋放,從而加快動脈粥樣硬化的進展[27]。分析看出,丹參飲可能通過多種疾病通路、信號通路治療心絞痛。

綜上所述,通過網絡藥理學這種新思路、新方法探究發現,丹參飲通過多種靶點、多種生物過程和通路治療心絞痛,可能包括抗炎、抗氧化、改善內皮功能、促進血管生成等作用,但仍有部分結果需要進一步實驗研究,為臨床診療提供理論依據[28]。