耳穴貼壓改善家兔腹部術后胃腸功能的作用機制研究

黃惠榕，薛佳璐，余真鈴，余夢霞，吳翠娟，仇志琴

術后胃腸功能紊亂(Postoperative Gastrointestinal Disorder，PGID)是指術后患者胃腸內容物傳輸延遲，出現不同程度的腹痛、腹脹、惡心、嘔吐及自主排氣排便時間延長等癥狀[1]。研究顯示，腹部術后24 h內，胃腸功能紊亂發生率高達10%～30%[2]，主要因為手術對胃腸器官牽拉、創傷，術中麻醉及術后鎮痛藥物的使用，術后患者禁食、長期臥床等[3]。若術后胃腸功能紊亂未及時處理，可導致腸梗阻、腸粘連、全身炎癥反應綜合征等一系列嚴重并發癥。目前術后胃腸功能紊亂發病機制尚未明確，可能與神經、體液、肌源性三大調節系統失衡有關[4]。胃腸Cajal間質細胞是一類在胃腸道發現的具有產生慢波，調節胃腸道節律性運動特殊功能的間質細胞[5]，其特異性表達C-kit蛋白，這是Cajal間質細胞發育和功能表現的標志[6]。誘導型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)僅在應激創傷狀態下表達在巨噬細胞上，催化產生大量一氧化氮，通過影響Cajal細胞抑制胃腸蠕動[7]。耳穴貼壓是指于耳穴處貼上藥豆或磁珠，按壓刺激耳部穴位使其產生酸、麻、脹、熱等感覺的一種傳統中醫外治療法[8]。前期本課題組臨床研究發現，耳穴貼壓應用于腹腔鏡術后患者可縮短患者肛門排氣時間，緩解術后腹脹和患者焦慮，降低術后應激狀態[9]，但對其相關作用機制尚未闡明。因此，本研究以結腸吻合術胃腸功能紊亂家兔模型為研究對象，運用免疫印跡法及免疫組化方法測量C-kit蛋白陽性表達與iNOS活性，探討Cajal間質細胞介導術后胃腸運動紊亂的機制，為闡明該療法治療術后胃腸功能紊亂提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年健康SD清潔型家兔共30只，雌雄各半，體質量2.0～2.5 kg，由福建中醫藥大學實驗動物中心代購并飼養[動物許可證號：SYXK(閩)2020-0003]，并通過福建中醫藥大學醫學倫理委員會批準(批號：2020048)。嚴格按照福建中醫藥大學實驗動物管理與保護的有關準則飼養實驗動物，開展實驗。將30只SD清潔型家兔按照隨機數字表法分為空白組、模型組、耳穴組各10只。

1.2主要實驗試劑與設備 10%水合氯醛(天津市大茂化學試劑廠)；4%多聚甲醛(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；兔eECL試劑盒(美國Advansta公司)；兔抗C-kit蛋白陽性表達與iNOS活性，即BCA蛋白試劑盒(HonorGene公司)；離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.3模型制備 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量0.33 mL/100 g。將麻醉好的家兔仰臥位固定于手術板上，常規備皮、消毒、鋪無菌巾，于下腹部正中逐層入腹，切口長約2 cm，找到家兔盲腸下2 cm處結腸剪斷，原位縫合后關腹。手術過程中注意保暖，至動物清醒后將其放于籠中，單籠飼養。干預期間定期更換切口敷料，防止感染。手術當天禁食，術后第1、2天流質飲食，將溫開水與芝麻糊按6∶1配成70 g。第3天后予固體兔糧喂養，50 g/只至干預結束。

1.4干預方法 ①耳穴組于造模成功后耳穴貼壓胃、大腸、耳中穴。根據《實驗針灸學》[10]耳穴定位圖中定位方法確定穴位區域。胃：位于耳輪腳基部周圍區；耳中穴：位于耳輪腳基部正中；大腸穴：位于耳甲腔內側下1/3。具體操作：術后經穴探測儀器輔助定穴，取穴后常規消毒，0.5 cm×0.5 cm無菌膠布粘貼王不留行籽固定于相應穴位，單側取穴，每3天更換至對側耳穴，用示指和拇指按壓，手法由輕到重，3次/d，每次每穴30 s，連續干預7 d。②模型組只進行造模術不干預。③空白組不進行任何干預。

1.5評價方法 ①首次排便時間、術后腸鳴音恢復時間。從腹部手術后6 h開始，1次/2 h觀察并記錄各組術后首次排便時間、術后腸鳴音恢復時間。②血清皮質醇濃度。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定各組術后6 h、術后第3天以及干預結束時的血清皮質醇濃度。③小腸推進率。使用灌胃注射針抽取2 mL墨水灌胃，30 min后用10%水合氯醛(0.4 mL/kg)腹腔注射，過量麻醉后處死動物，剖開腹部暴露胃腸道。直尺測量小腸全長及幽門到墨水前沿推行的距離，推行長度值除以小腸全長，得出小腸推進率。④實驗室相關指標。以結腸吻合口為中央、取1 cm結腸，用0℃生理鹽水清洗內容物。縱向分為2份，分別用于免疫印跡檢測C-kit蛋白陽性表達和免疫組化測iNOS活性。免疫印跡法檢測C-kit蛋白陽性表達方法：提取蛋白；制備電泳凝膠；蛋白質電轉移；蛋白質的免疫印跡；蛋白質的化學發光(ECL)檢測；灰度分析。免疫組化法檢測iNOS表達方法：脫水；石蠟切片；脫蠟；淬滅內源性過氧化物酶；抗原修復；加一抗；加二抗；DAB顯色；復染細胞核；脫水封片。

1.6統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行統計描述、t檢驗、單因素方差分析及重復測量的方差分析，采用LSD法進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1兩組術后首次排便時間、腸鳴音恢復時間比較 見表1。

表1 兩組術后首次排便時間、腸鳴音恢復時間比較

2.2三組術后不同時間血清皮質醇濃度比較 見表2。

表2 三組術后不同時間血清皮質醇濃度比較

2.3三組小腸推進率比較 見表3。

表3 三組小腸推進率比較

2.4三組C-kit蛋白陽性表達及iNOS活性比較 見表4。

表4 三組C-kit蛋白陽性表達及iNOS活性比較

3 討論

3.1耳穴貼壓有助于縮短腹部術后家兔首次排便時間與腸鳴音恢復時間，提升小腸推進率 耳穴貼壓在調節術后胃腸功能中運用廣泛。王曉慶等[11]對耳穴貼壓干預患者術后胃腸功能恢復的相關文獻進行Meta分析，結果顯示耳穴貼壓療法可明顯縮短患者術后排氣時間、排便時間，促進腸鳴音恢復，改善腹脹的癥狀。耳穴分布全息律指出：耳廓的陽性反應點可反映相應臟腑的機能狀態，當某一器官、臟腑功能異常時，可以通過刺激相應的耳部穴區來治療[12]。刺激耳穴胃區有助于促進結腸平滑肌運動，改善胃腸蠕動[13]。本研究結果顯示，耳穴組家兔首次排便時間與腸鳴音恢復時間顯著早于模型組，且耳穴組小腸推進率顯著高于模型組(均P<0.05)，提示耳穴貼壓對調節腹部術后家兔的胃腸功能具有積極作用。

3.2耳穴貼壓有助于降低腹部術后家兔應激反應 應激反應是指機體受到刺激導致交感神經-腎上腺髓質系統興奮，下丘腦-垂體-腎上腺皮質分泌功能活躍，引起機體各種功能和代謝變化的過程[14]。血清皮質醇是反映應激狀態的敏感指標，測定血清皮質醇濃度能有效反映機體的應激水平。本研究對三組家兔術后6 h、3 d、7 d的血清皮質醇進行檢測，結果顯示干預效應、時間效應、交互效應顯著，術后6 h、3 d模型組和耳穴組的血清皮質醇顯著高于空白組，且術后3 d時耳穴組顯著低于模型組(均P<0.05)。反映手術后家兔處于應激狀態，分泌血清皮質醇增多，且耳穴貼壓有助于降低術后家兔的應激反應，與魏麗君等[15]的研究結果一致。術后7 d三組血清皮質醇濃度差異無統計學意義(P>0.05)，可能因為術后7 d胃腸道功能逐步恢復，機體應激反應減弱。模型組術后6 h、3 d、7 d血清皮質醇濃度兩兩比較有顯著差異，而耳穴組術后3～7 d無顯著差異，反映耳穴貼壓能加速機體抑制腹部術后的應激反應。研究表明，耳穴貼壓能降低剖宮產術后及不孕患者行體外受精-胚胎移植術后的血清皮質醇濃度[16]，可能與耳穴貼壓有助于調節機體應激反應有關。

3.3耳穴貼壓有助于降低iNOS表達，促進C-kit蛋白陽性表達 iNOS僅在應激狀態下高度表達，胃腸手術的應激狀態使巨噬細胞上調iNOS表達，并產生一氧化氮作用于Cajal細胞，抑制其產生起搏電位，使得平滑肌松弛，過多的一氧化氮可激活胃腸道內的巨噬細胞發揮其細胞毒性，引起胃腸組織損傷[17]。Cajal細胞是胃腸運動的起搏細胞，腹部手術破壞胃腸道的完整性，Cajal細胞數量減少且網絡結構破壞[18]。C-kit蛋白作為Cajal細胞的特異性標志物，具有調控Cajal細胞增殖與發育的作用[19]。本研究結果表明，iNOS活性水平在耳穴組和模型組之間差異顯著，耳穴組iNOS活性水平與空白組家兔結果接近；耳穴組干預后C-kit蛋白濃度顯著高于模型組，但低于空白組，提示耳穴貼壓有助于減少iNOS表達與催化，降低一氧化氮對Cajal細胞的抑制作用；耳穴貼壓在一定程度上可促進C-kit蛋白表達，促進Cajal細胞修復與增殖，有助于胃腸蠕動恢復。

3.4基于氣機升降理論耳穴貼壓改善腹部術后胃腸功能的機制 《素問·六微旨大論篇》曰：“是以升降出入，無器不有?！盵20]氣機的升降出入運動是人體生命活動和臟腑功能的基本表現形式，若氣機運動失常便會引發疾病。脾宜升則健，胃宜降則和，脾胃為臟腑氣機升降之樞紐，人體之斡旋[21]。脾胃氣機出現升降不及或升降反作，則可直接導致胃腸運動功能障礙[22]。中醫學通常將術后胃腸功能紊亂歸屬于“腸痹”“腸結”等范疇，認為術后脾胃氣虛氣滯，腑氣不通，脾胃升降失常是胃腸功能障礙的病機所在[23]。本研究結果顯示，耳穴貼壓有助于促進家兔腹部術后胃腸蠕動，降低應激反應，加速胃腸動力恢復。耳廓的經絡與神經分布豐富，并與人體的臟腑經絡組織一一對應?！鹅`樞》記載：“十二經脈，三百六十五絡，其血氣皆上于面而走空竅。共別氣走于耳而為聽”[24]。刺激耳穴陽性反應點對于相應的臟腑經絡組織可以起到疏通經絡、調暢氣血作用[25]。本研究選取胃、大腸、耳中皆為腹部穴位，胃主納降下行，大腸主傳化糟粕、主津，耳中穴主要調節胃的功能，對上述穴位進行按壓刺激，共同調節胃腸氣機，推動清氣上升濁氣下降，順氣導滯，臟腑氣機正常運行，從而促進術后胃腸功能恢復。

綜上所述，耳穴貼壓通過調節機體應激水平來控制因手術等應激反應而發生表達的iNOS，并促進C-kit蛋白表達，促進Cajal細胞增殖與修復是其可能機制之一，這可為耳穴貼壓早期干預腹部術后提供理論依據。但其具體的作用通路目前尚不清楚，同時Cajal細胞表達受到如炎癥因子、配體血清干細胞因子、腸神經系統等諸多因素的影響，耳穴貼壓療法是否能對其調節進而影響Cajal細胞，需要進一步研究證實。