MaReCs技術在染色體平衡易位攜帶者胚胎移植中的應用

宋歌 米冬青 孟繁玉 蔣彥 賈博欽 周曉璞 吳小華

染色體易位在不良孕產史患者中是一種染色體常見的結構異常，是指兩條染色單體發生斷裂后，相互交換并且重新連接形成兩條新的染色體的現象[1]。易位患者的染色體數目和遺傳物質通常不發生變化，故對攜帶者本人在表型上沒有太大影響，但是在其向下一代傳遞過程中會發生錯配，容易出現不孕不育、反復流產、反復種植失敗和出生缺陷等情況的發生[2,3]。家族遺傳和新發突變都可以導致染色體易位的發生，在正常人群中染色體易位的發生率只有2‰左右[4]，但在反復不良孕史夫婦中易位的發生比率接近1/10。如果患者夫婦其中一人作為平衡易位的攜帶者，那么他們生育的子女發生染色體片段不平衡的比例會大大提高，流產、不孕或出生子女患有先天性缺陷疾病的風險也會增高[5，6]。胚胎植入前遺傳學檢測技術(perimplation genetic testing,PGT)就是在體外受精-胚胎移植技術(IVF-ET)的基礎上[7]，使用全染色體篩查技術，如二代測序等全基因組測序方法對體外受精中形成胚胎的非整倍性進行植入前檢測，可實現篩選出平衡的整倍體胚胎，進而可以避免染色體不平衡胚胎植入宮腔，這是現有的應用較多的技術。但是，易位的攜帶狀態與否是我們使用常見的全染色體篩查技術無法確定的[8]，因此不能確保子代完全不攜帶易位基因。眾所周知，在我們進行體外受精過程中，利用現有的方法確定胚胎是否攜帶染色體易位狀態是非常困難的。Xu等[8]建立了一種診斷染色體異常的方法，稱為MaReCS技術，該技術借助全基因組擴增和下一代測序技術可以同時對胚胎進行染色體整倍性的篩查和易位攜帶狀態的辨別，它可以為平衡易位攜帶的患者精確地挑選出不含易位攜帶的胚胎進行移植。本文報道河北省首例對染色體平衡易位患者應用MaReCS技術，鑒別出不攜帶易位的胚胎植入子宮后成功妊娠，經過胎兒羊水細胞核型分析印證了該攜帶狀態篩査的準確性，最終分娩出不攜帶平衡易位的健康新生兒，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者，女，28歲，因原發不孕6年，子宮肌壁間多發肌瘤，兩側輸卵管通暢欠佳，男方少弱畸精子癥來我中心就診，男方染色體 46，XY，t(12；22)(q13；q13)。患者夫婦雙方在經過充分的遺傳咨詢后，要求選擇PGT助孕并簽署PGT知情同意書。

1.2 胚胎培養與活檢樣本采集 患者于2019年2月采用卵泡期超長方案進行降調節，Gn用量HMG 2 675 U，人絨毛膜促性腺激素10 000 U注射后36 h取卵，獲卵13枚，MⅡ卵子12枚，取卵日采用卵胞漿內單精子顯微注射(ICSI)進行授精，2PN 12枚，之后采用G系列序貫培養系統在在37℃三氣培養箱(5%CO2，5%O2和90%N2)中進行胚胎培養，受精后第5、6天胚胎培養至囊胚階段，通過觀察胚胎和囊胚評分，發現共形成2枚可利用囊胚，囊胚評分級別是4BC×2，用激光法對這2枚囊胚進行滋養外胚層活檢，每枚囊胚活檢3～5個細胞，活檢后的囊胚逐一進行玻璃化冷凍，于液氮罐中保存。經檢測該2枚囊胚均為異常胚胎，因本周期胚胎中無染色體拷貝數正常(46，XN)的樣本，無法進行下一步胚胎染色體易位攜帶檢測。遂患者于2019年4月再次行ICSI助孕，采用拮抗劑方案，獲卵17枚，受精11枚，形成3枚囊胚，經活檢后檢測1枚胚胎未見染色體拷貝數異常。患者在充分知情同意后，選擇應用MaReCs技術對該枚平衡胚胎的易位狀態做進一步的區分，結果此枚胚胎不攜帶平衡易位。患者經過充分遺傳咨詢后，于2019年11月選擇該未攜帶易位的且不存在拷貝數變異的4BC囊胚進行解凍復蘇移植，14 d后測檢測血HCG 1 709 U/L，28 d后B超觀察到孕囊，可確認獲得了臨床妊娠；患者在孕周22+5時羊水穿刺獲得胎兒羊水細胞，產前診斷的方法是高通量DNA測序，同時STR連鎖分析進行檢測基因組拷貝數變異(CNVs)，結果顯示該樣本未檢出染色體非整倍體或>100 kb已知、明確致病的CNVs。應用G顯帶方法對患者胎兒羊水細胞進行染色體核型檢測，發現胎兒羊水細胞染色體檢查未見數目及結構異常，這也進一步驗證了PGT結果的準確性。

1.3 MaReCS檢測

1.3.1 第一階段：活檢細胞放入樣本保存管，使用基于 MALBAC 原理改良的基因測序通用樣本處理試劑盒(XK-028，Yikongenomics)進行全基因組擴增，構建文庫并進行高通量測序(next generation sequencing，NGS)[9-11]，使用Illumina Nextseq550測序平臺，每個樣品產生3～5 M讀長(reads)的數據量，從測序結果中去除測序接頭和低質量堿基后，分析每個樣品的 CNVs，參考Li等[11]進行生物信息學分析并結合胚胎情況明確斷裂位點，精確±200 kb。

1.3.2 第二階段：采集男女雙方外周血，采用通用型柱式基因組提取試劑盒(CW2298M，cwbio)。于斷點上下游3M范圍內設計單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點，采用多重PCR方法擴增，并構建文庫，經高通量測序，數據經分析后構建SNP單體型。

1.4 產前診斷 采用高通量測序檢測CNVs，采用羊水細胞染色體核型分析胎兒染色體數目和結構異常。

1.5 臨床結局跟蹤 在患者移植術后隨訪跟蹤顯示，術后14 d，血HCG 1 709.64 U/L；術后21 d，血HCG 15 000 U/L；術后28 d，在B超下觀察到孕囊26.3 mm；孕22+5周時，羊水穿刺獲得胎兒羊水細胞；患者于2020年7月于我院產科順利分娩出一男嬰，體重3 920 g，健康狀況良好。

2 結果

2.1 MaReCS檢測結果

2.1.1 第一階段檢測結果：患者2個周期，共5個囊胚活檢樣本：其中1個樣本未見染色體拷貝數異常，4個樣本染色體拷貝數異常；根據901和902樣本，分析斷裂點位置：chr12:51,900,(001±200)k；chr22:48,900,(001±200)k。見表1。

表1 活檢樣本的CNV結果

2.1.2 第二階段檢測結果：通過家系樣本構建SNP單體型，進一步區分出903未見拷貝數異常的胚胎是不攜帶平衡易位的。903染色體易位攜帶檢測結果。見表2。

表2 0903樣本的MaReCs檢測結果

2.2 胎兒羊水細胞產前診斷檢測

2.2.1 胎兒羊水高通量測序檢測結果：該樣本未檢出染色體非整倍體或100 kb以上已知、明確致病的基因組拷貝數變異(CNVs)。見圖1。

圖1 胎兒羊水細胞CNV圖

2.2.2 胎兒羊水細胞染色體核型分析結果：46，XN，未見數目及結構異常。見圖2。

圖2 胎兒羊水細胞染色體核型

3 討論

據報道，河北省平均每100個出生嬰兒中就會出現1個出生缺陷兒[12]。河北省作為人口大省和出生缺陷高發地區之一，該技術的應用在降低出生缺陷，提高人口質量方面尤為重要。

近年來，不良孕產史疾病中復發性流產和胚胎停育較為常見，造成流產或胎停的重要原因之一就是染色體易位[13]。眾所周知，通過PGT技術可以篩選出平衡的整倍體胚胎，進而可以避免染色體不平衡胚胎植入宮腔所造成的反復流產或種植失敗的發生。不同檢測方法的運用，直接影響了PGT檢測結果的準確性[14]。眾所周知，在我們進行體外受精過程中，利用現有的方法確定胚胎是否攜帶染色體易位狀態是非常困難的。那么，如何保證染色體易位攜帶者能夠生出完全健康的孩子一直以來都是學者研究討論的難題[7]。MaReCS[11]技術，作為一種新型的PGT技術，它將MALBAC全基因組擴增技術與NGS技術相結合，分為2個階段，首先活檢細胞經過MALBAC-lab技術擴增后，進行高通量測序，構建文庫、測序后得到染色體CNVs，區分染色體拷貝數正常和異常的胚胎，經過生物信息學分析，明確易位斷裂點；其次易位斷點識別出之后進而進行SNP連鎖分析，我們通過查找SNP位點，設計SNP位點引物，構建單倍型，方能區分出正常胚胎與平衡易位攜帶胚胎，從而阻止染色體平衡易位向下一代的傳遞。該技術借助全基因組擴增和下一代測序技術可以同時對胚胎進行染色體整倍性的篩查和易位攜帶狀態的辨別，它可以為平衡易位攜帶的患者精確地挑選出不含易位攜帶的胚胎進行移植。

在本文病例中，患者雙方在PGT之前進行了詳細的遺傳咨詢，充分了解該技術存在的局限性及風險后，自愿選擇PGT，并簽署知情同意書，移植1枚非易位攜帶的胚胎并成功妊娠，孕期做胎兒羊水穿刺后檢測胎兒羊水細胞染色體檢查未見數目及結構異常。有學者此前報道，應用MAReCs技術能夠區分胚胎的染色體易位攜帶狀態，30個平衡胚胎被成功區分為21個正常胚胎和9個易位攜帶胚胎，使得易位不再向子代傳遞[15]，這與我們的病例報道相符。該項技術做為河北省首次嘗試應用MaReCs技術篩選出沒有發生平衡易位的胚胎，植入子宮后成功妊娠，經過羊水核型分析驗證了該攜帶狀態篩查的準確性，最終分娩出不攜帶平衡易位的健康新生兒，截止發稿時其生長發育各項指標均正常，我們這個病例成功有效的阻止了染色體平衡易位向下一代的傳遞，是河北省MaReCs技術的首位獲益者，填補了河北省PGT技術相關技術領域的空白。

MaReCs技術不需要做預實驗，操作也并不復雜，其實用性在于只需要采集夫妻血樣就可以完成鑒定出胚胎的易位攜帶狀態，而且無論易位是否是遺傳的還是患者新發突變，都可以對胚胎進行區分。但是MaReCs技術的缺點是要求患者有多枚胚胎參與檢測，如果檢測出所有胚胎均是平衡胚胎或有非平衡胚胎但我們沒有辦法判斷出其斷裂位點時，沒有參照胚胎就沒有辦法進行第二步的檢測。因為需要找出參照胚胎才能找出斷裂位點，該實驗才能往下繼續進行。我們中心在之前的平衡易位攜帶者進行的PGT周期中，就是因無法找到參考胚胎，所以無法進行MaReCs第二階段的測定，所以只是幫助患者找到平衡胚胎進行復蘇移植，不能確定移植的胚胎是否攜帶有平衡易位。但是一旦找到參照胚胎，就能夠使易位患者生育完全健康的孩子，且不影響子代的生育問題，這方面的意義是及其重大的。因此，我們有理由期待MaReCS技術將會幫助減少平衡易位和羅氏易位在人群中的傳遞。此外，除了平衡易位，目前我中心還將MaReCs技術應用在羅氏易位和染色體臂間倒位的病例中，它能有效避免因平衡易位攜帶而導致流產以及流產給患者帶來的創傷，為河北省優生優育做出了相應的貢獻，也為PGT技術在我省的推廣起到了重要作用。