LINC00511調控NF-κB通路對多囊卵巢綜合征卵巢顆粒細胞凋亡和炎性反應的影響

衛玲 張燕 陳曉娟

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡女性最常見的內分泌疾病，主要表現為雄激素分泌過多、竇卵泡生長停滯和慢性炎癥，其嚴重影響患者的生理和心理健康[1]。PCOS進展可能涉及遺傳、內分泌、代謝等多種因素，但其確切發病機制仍不清楚[2]。卵巢顆粒細胞是卵泡中最重要的體細胞，可合成多種激素及生長因子，參與調控卵泡發育，而顆粒細胞異常凋亡、炎性反應可誘導PCOS病理進程[3,4]。因此，研究卵巢顆粒細凋亡機制、抑制細胞炎性反應對指導PCOS的臨床治療至關重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度>200 nt的RNA轉錄本，特定lncRNA的表達增加或缺失均可引起細胞基本活動異常，導致疾病進展。LINC00511是近年發現的致癌lncRNA，有研究報道其表達上調與宮頸癌的惡性狀態有關，并可促進癌細胞的增殖和轉移[5]。LINC00511還能促進乳腺癌細胞干性和腫瘤形成，其高表達提示乳腺癌患者預后不良[6]。然而，筆者查閱文獻后發現LINC00511在PCOS中的功能尚不清楚。本研究分析LINC00511對PCOS卵巢顆粒細胞凋亡以及炎性因子表達的影響，以期為PCOS治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人正常卵巢上皮細胞IOSE-80購自上海賽百慷生物公司；人卵巢顆粒細胞KGN購自深圳華拓生物科公司；PrimeScript逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II試劑盒、TRIzol試劑購自大連takara公司；si-LINC00511、si-NC、pcDNA-LINC00511、pcDNA購自上海漢恒生物公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V-FITC)凋亡檢測試劑盒購自南京碧波生物科技公司；人白細胞介素1β(IL-1β)酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒、人IL-6 ELISA檢測試劑盒、兔源剪切型半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)單克隆抗體(AC033)、兔源β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(AF5003)購自上海碧云天生物公司；磷酸化核因子κB(p-NF-κBp65，p-p65)單克隆抗體購自上海鈺博生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：IOSE-80細胞、KGN細胞分別采用RPMI-1640、DMEM培養基培養，培養基中均添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗，置于含95%空氣、5%二氧化碳、37℃、80%濕度的溫箱孵育。當細胞長至培養瓶>90%時1∶3傳代。

1.2.2 RT-qPCR檢測LINC00511表達：TRIzol法提取KGN細胞和IOSE-80細胞的總RNA，用PrimeScript逆轉錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉錄為cDNA，再用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行RT-qPCR。LINC00511表達歸一化為β-actin，用2-ΔΔCt法計算LINC00511表達量。引物序列為LINC00511上游5’-CTAACAAGAGGGTAAGTGTCAG-3’，LINC00511下游5’-AAGTCGACAACCCCATCGTTAC-3’；β-actin上游5’-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3’，β-actin下游5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3’。

1.2.3 實驗分組：將對數期KGN細胞按2×104個/孔的密度接種24孔板，當細胞長至培養板底部的50%，用lipofectamine 2000將50 nmol/L si-LINC00511、50 nmol/L si-NC、2 μg pcDNA-LINC00511、2 μg pcDNA轉染KGN細胞。轉染48 h收集細胞，RT-qPCR檢測LINC00511表達以驗證抑制或過表達效果。轉染si-LINC00511、si-NC、pcDNA-LINC00511、pcDNA的KGN細胞分別記為si-LINC00511組、si-NC組、pcDNA-LINC00511組、pcDNA組；用20 ng/ml的TNF-α[7]孵育轉染si-LINC00511細胞24 h記為si-LINC00511+TNF-α組。每次檢測設置3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡：PBS洗滌各組KGN細胞2次，加入適量1×結合緩沖液重懸細胞。吸取500 μl細胞懸液，依次加入5 μl Annexin-V-FITC和5 μl碘化丙啶，室溫避光孵育15 min。流式細胞儀分析各組KGN細胞凋亡情況。

1.2.5 ELISA法檢測細胞培養液中IL-6和IL-1β水平：細胞培養結束后，3 000 r/min離心10 min，收集細胞培養液上清，參照商品試劑盒說明書步驟檢測IL-6和IL-1β表達水平。

1.2.6 Western blot檢測Cleaved-caspase-3和p-p65蛋白表達：RIPA法提取各組KGN細胞總蛋白，每組取30 μg變性蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓100 V，時間100 min)，然后電轉(20 mA，時間12 h)至硝酸纖維素膜。加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再與Cleaved-caspase-3(1∶2 000稀釋)、β-actin(1∶3 000稀釋)、p-p65(1∶1 000稀釋)的一抗4℃搖床孵育10 h。隨后加入1∶2 500稀釋的酶標二抗，室溫孵育2 h。加入化學發光試劑檢測蛋白。Image J軟件分析各條帶相對于β-actin條帶灰度值以表示其蛋白表達量。

2 結果

2.1 DCOS卵巢顆粒細胞中LINC00511表達情況 與IOSE-802組細胞表達(1.00±0.10)比較，KGN細胞中LINC00511表達水平(2.41±0.04)顯著升高(P<0.05)。

2.2 LINC00511對KGN細胞凋亡的影響 si-LINC00511組KGN細胞LINC00511表達水平顯著低于si-NC組(P<0.05)，表明轉染si-LINC00511可抑制LINC00511表達。pcDNA-LINC00511組KGN細胞LINC00511表達水平顯著高于pcDNA組(P<0.05)，表明轉染pcDNA-LINC00511可促進LINC00511表達。與si-NC組比較，si-LINC00511組KGN細胞Cleaved-caspase-3蛋白表達、凋亡率顯著升高(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00511組KGN細胞Cleaved-caspase-3蛋白表達、凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 LINC00511對KGN細胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響;A 流式細胞儀檢測細胞凋亡；B Western Blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表1 LINC00511對KGN細胞凋亡的影響

2.3 LINC00511對KGN細胞炎性因子表達的影響 與si-NC組比較，si-LINC00511組KGN細胞培養液中IL-6和IL-1β水平顯著降低(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00511組KGN細胞培養液中IL-6和IL-1β水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 LINC00511對KGN細胞炎性因子表達的影響

2.4 LINC00511對KGN細胞中NF-κB信號通路蛋白表達的影響 與si-NC組比較，si-LINC00511組KGN細胞p-p65蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00511組KGN細胞p-p65蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表3，圖2。

圖2 Western Blot檢測p-p65蛋白的表達

表3 LINC00511對KGN細胞NF-κB信號通路蛋白表達的影響

2.5 TNF-α可以逆轉干擾LINC00511表達對KGN細胞凋亡以及炎性反應的影響 與si-LINC00511組比較，si-LINC00511+TNF-α組KGN細胞LINC00511表達水平、p-p65蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達、凋亡率顯著降低，細胞培養液中IL-6和IL-1β水平顯著升高(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 TNF-α可以逆轉si-LINC00511對KGN細胞凋亡以及細胞炎性反應的影響；A 流式細胞儀檢測細胞凋亡；B Western Blot檢測p-p65、Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表4 TNF-α可以逆轉si-LINC00511對KGN細胞凋亡以及細胞炎性反應的影響

3 討論

lncRNA是重要的基因表達調節因子，其表達異常與雄激素分泌、胰島素抵抗、卵泡發育、排卵等PCOS進展的多個環節密切相關，可能是PCOS治療的潛在靶標[8]。此外，研究證實lncRNA還可通過影響顆粒細胞增殖和凋亡在PCOS中發揮作用[9,10]。LINC00511已被報道在多種癌癥中發揮功能，研究顯示LINC00511表達水平與肝癌患者TNM分期、淋巴轉移相關，LINC00511高表達提示肝癌患者預后不良[11]。胃癌中LINC00511表達增加，敲減LINC00511可抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡[12]。LINC00511過表達可增強食管癌細胞增殖能力，促進細胞周期進展，抑制細胞凋亡[13]。此外，敲減LINC00511通過調控細胞惡性行為對宮頸癌、腎透明細胞癌、肺腺癌進展均有抑制作用[14，15]。本研究檢測到PCOS卵巢顆粒細胞KGN中LINC00511表達增加，提示LINC00511可能在PCOS進展中發揮調節因子作用。為探討LINC00511對KGN細胞功能的影響，本研究分別轉染si-LINC00511、pcDNA-LINC00511至KGN細胞，結果顯示干擾LINC00511表達可誘導細胞凋亡，并上調促凋亡Cleaved-caspase-3蛋白表達，而過表達則具有相反作用，這與之前研究報道[12]相似。

PCOS的發展通常伴隨著慢性炎癥，主要表現為IL-6、IL-1β等促炎因子產生增加，這些促炎因子的失調可能損害卵泡發育和成熟[16]。本研究顯示干擾LINC00511表達降低IL-6和IL-1β水平，而過表達LINC00511則增加IL-6和IL-1β水平，這表明干擾LINC00511表達可抑制KGN細胞炎性反應。NF-κB是炎癥過程的關鍵介質，正常情況下NF-κB可與細胞質中的IκB形成無活性復合物，當受到刺激后NF-κB易位到細胞核，調節炎性因子基因表達。研究表明，加味芍藥甘草湯可抑制NF-κB通路活化來調節局PCOS大鼠卵巢部炎性反應，進而改善卵巢功能[17]。此外，lncRNA類固醇受體RNA激活劑(SRA)對NF-κB通路亦具有調控功能，沉默lncRNA SRA能夠抑制NF-κB核轉位，抑制PCOS小鼠卵巢顆粒細胞促炎細胞因子分泌，減輕卵巢損傷[18]。本研究顯示，干擾LINC00511表達可抑制p65的磷酸化，過表達可促進p65的磷酸化，表明干擾LINC00511表達可抑制NF-κB通路活化。有報道稱NF-κB可能通過激活Caspase-3表達來誘導PCOS卵巢顆粒細胞凋亡[19]。本研究發現，采用TNF-α激活NF-κB通路可拮抗干擾LINC00511表達對KGN細胞凋亡、IL-6和IL-1β水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響，這進一步表明干擾LINC00511通過抑制NF-κB通路參與調控PCOS卵巢顆粒細胞凋亡和炎性反應。

綜上所述，干擾LINC00511通過抑制NF-κB通路從而誘導PCOS卵巢顆粒細胞凋亡，抑制炎性反應，這些發現可能為PCOS提供潛在治療靶點。