食管鱗癌上皮內瘤變中雄激素受體和P53蛋白表達與異型程度的相關性研究

夏秀麗 趙樹山

食管癌是世界上最常見的惡性消化道腫瘤之一，其發病率和死亡率分別據第7位和第6位[1]，具有明顯地域聚集性和性別差異。亞洲國家中發病率最高，中國屬于食管癌高發國家，每年新發病例約占全球的一半,而且與西方國家明顯不同的是我國食管癌的組織病理類型以鱗癌為主，占所有食管癌的90%以上[2-4]，河北、河南及山西交界處的太行山區屬于食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)高發區，性別差異體現在全球范圍內男性總體發病率是女性的3～4倍[5]，男女之比為：中國2∶1、法國5∶1、澳大利亞和瑞典6∶1、美國8∶1、英國10∶1[6]。美國流行病學調查顯示1973至2008年，男性ESCC發病率顯著上升，而女性的上升速度較慢，男女比例為7.66∶1[7]。與其他實體腫瘤相似，ESCC的發生也要經過癌前病變、早期癌、進展期癌等各個階段。對于高級別上皮內瘤變和早期癌，治療后患者5年生存率可>90%，而對于中晚期ESCC患者即使治療其5年生存率亦<20%，所以早期識別ESCC患者是降低患者死亡率的關鍵因素之一。因此，早診斷、早干預對于降低死亡率尤為重要。近期國內外多位學者報道了雄激素受體(androgen receptor,AR)在ESCC組織中呈陽性表達且P53蛋白易出現在AR陽性的鱗癌組織中，證實了AR和P53蛋白與ESCC的嚴重程度密切相關[8-10]，但筆者發現上皮內瘤變與兩者的相關性鮮有報道。因此，本研究通過檢測我院收治的120例ESCC不同程度上皮內瘤變患者與正常人群食管黏膜組織中AR和P53蛋白的表達情況，初步明確了兩者與該病變的相關性，從而有助于臨床上食管癌的早期診斷和干預，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年6月我院收治的ESCC上皮內瘤變患者與正常人群食管黏膜標本共120例，分為正常組，輕度、中度及重度不典型增生組，每組30例。正常組男19例，女11例；年齡46～80歲，平均年齡(52.6±7.7)歲；輕度不典型增生(輕度)組男21例，女9例；年齡(32～75)歲，平均年齡(50.2±6.5)歲；中度不典型增生(中度)組男18例，女12例；年齡(36～69)歲，平均年齡(49.7±8.1)歲；重度不典型增生(重度)組男20例，女10例；年齡(39～71)歲，平均年齡(51.9±6.1)歲。

1.2 食管黏膜標本分類標準 (1)正常上皮：上皮層含有基底細胞1～3層，基底細胞呈多角形或橢圓形，核為圓形或橢圓形，緊靠基底膜的為內底層細胞，通常是一層矮柱狀細胞，核呈圓形，乳頭高度低于上皮全層一半；(2)輕度不典型增生：異型細胞主要位于上皮基底層或不超過上皮全層下1/3；(3)中度不典型增生：異型細胞達到上皮中層或不超過上皮全層下2/3；(4)重度不典型增生：異型細胞超過上皮層下2/3，上皮全層幾乎被異型細胞占據，但基底膜完整。

1.3 儀器與試劑 全自動生物組織脫水機、生物組織包埋機、石蠟切片機和一次性切片刀均來自德國LEICA公司；全自動免疫組化機和二抗及顯色系統來自美國羅氏公司；攤片機(TKD-TP)；烤箱(恒宇HH-B11)；顯微鏡(OLYMPUS-BX51)；粘附載玻片及鼠抗人雄激素受體和P53單克隆抗體(福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.4 免疫組化檢測方法及陽性標準 (1)將4組食管石蠟標本采用卵白素-生物素-辣根過氧化物酶復合物法進行免疫組織化學分析：標本脫蠟、酒精至水，微波抗原修復后依次0.5% H2O2、馬血清室溫孵育20 min，加一抗后4℃冰箱孵育12 h后滴加稀釋后的鼠單克隆抗體(二抗)再次孵育45 min；加入ABC室溫孵育60 min；加入二氨基聯苯胺和H2O2孵育后在顯微鏡下觀察，適時終止反應；最后用蘇木素復染后酒精脫水、透明、中性樹膠封固。采用已知的陽性食管組織切片作陽性對照，生產第二抗體的正常動物血清封閉非特異性免疫球蛋白反應與省略第一抗體作為陰性對照。(2)陽性標準：以細胞質或細胞核內出現棕色顆粒為AR陽性細胞，在×400倍鏡下觀察切片，隨機觀察5個視野，每視野計數200細胞，共計1 000個細胞，陽性細胞數>10%則算AR陽性；P53陽性標準為鏡下出現≥3個細胞核呈棕黃褐色。

2 結果

2.1 4組間AR陽性率比較 正常組與輕度、中度、重度不典型增生組相比結果依次為(χ2=0.517,P=0.472)、(χ2=3.491,P=0.062)、(χ2=7.067,P=0.008)，正常組與重度不典型增生組差異有統計學意義(χ2=7.06，P=0.008)；輕度與中度、重度不典型增生組比較結果為(χ2=0.647,P=0.421)、(χ2=4.320,P=0.038)，輕度與重度不典型增生組差異有統計學意義(χ2=4.320，P=0.008)；中度與重度不典型增生組比較，差異無統計學意義(χ2=0.884,P=0.347)。見表1，圖1。

表1 4組人群AR陽性率比較 n=30，例(%)

圖1 4組食管黏膜組織鏡下表現(免疫組化×400)；A 正常組;B 輕度不典型增生組;C 中度不典型增生組;D 重度不典型增生組

2.2 4組間P53陽性率比較 正常組與輕度、中度、重度不典型增生組相比結果分別為(χ2=0.300,P=0.584)、(χ2=4.344,P=0.037)、(χ2=11.279,P=0.001)，正常組與中、重度不典型增生組差異有統計學意義；輕度與中度、重度不典型增生組比較結果為(χ2 = 2.411,P=0.121)、(χ2=8.148,P=0.004)，輕度與重度不典型增生組差異有統計學意義；中度與重度不典型增生組比較結果為(χ2=1.832,P=0.176)，差異無統計學意義。見表2。

表2 4組人群P53陽性率比較 n=30，例(%)

2.3 AR和P53表達的相關性 中重度不典型增生組中AR和P53陽性表達呈正相關(r=0.869，雙側Pearson檢驗P=0.005<0.05)。見表3。

表3 AR與P53在中重度不典型增生組中表達的相關性 例

3 討論

3.1 AR與食管鱗癌上皮內瘤變的關系 AR屬于核受體家族成員，通過受體轉位途徑進入細胞核發揮作用，已證明其與多種腫瘤密切相關[11]。河北省屬于ESCC的高發地區，既往研究關注點在食管鱗癌進展階段且證實了雌、孕激素受體和P53蛋白以及相關血漿標志物、基因突變等與食管鱗癌的嚴重程度有關[12-14]。由于該病明顯的男性聚集性，故又啟發了國內外對AR與食管鱗癌相關性的研究。張英國等[15]對比了67例食管鱗癌組織與30例正常食管黏膜中AR的表達情況，也得到了相似結論，發現AR陽性率超過80%且表達于細胞核。McMenamin等[16]用免疫組織化學方法檢測到ESCC切除標本中AR陽性表達率為21%(3/14)。

隨著胃鏡的普及，食管鱗癌的檢出率明顯升高，但是大多已經進展到中晚期，臨床療效不佳，有關研究已證實了血清性類固醇激素與男性 Barrett食管發展的相關性，并且證明了該病變與游離睪酮有很強的正相關性，由此推測出Barrett食管中可能存在AR表達[17,18]。但也有人得出了相反的結論，Nordenstedt等[19]未能從10名Barrett食管的黏膜活檢組織中識別出AR，而在20名對照組中只有1人(10名男性和10名女性)在鱗狀上皮中檢測到了AR，其認為Barrett食管中無AR意味著應該尋找其它病因來解釋Barrett食管和食管腺癌中男性高發病率的原因。由此可見，關于AR與食管癌前病變的關系至今仍不明確，但屬于當今研究的熱點，對于我國更加常見的食管鱗癌類型，AR與鱗癌上皮內瘤變的關系仍不明確，但是對于早期確診該病變有重要意義，所以本研究通過對我院收治的處于不同階段的食管鱗癌上皮內瘤變患者與正常人群食管粘膜組織AR表達情況對比研究，發現正常組與重度不典型增生組、輕度與重度不典型增生組差異有統計學意義，說明食管重度不典型增生組織中存在AR高表達情況，表明重度異型組更容易進展為ESCC，與我國之前的研究[20-22]一致。

3.2 P53蛋白與食管鱗癌上皮內瘤變的關系 P53抑癌基因突變是人類癌癥中最常見的基因改變，突變發生在所有常見的癌癥中，在任何一種類型中，都可能有一半或更多的單個腫瘤受其影響，在29%～80%的惡性腫瘤中也發現了P53蛋白水平升高，但在良性腫瘤和正常組織中卻很少見，參與了細胞內多種病理生理過程[23]。P53蛋白可以反映突變的程度，因此通過免疫組織化學方法檢測組織中突變型P53蛋白表達水平可以反映癌變的嚴重程度。

最早Benett通過對9例食管癌前病變標本中P53蛋白水平檢測發現有6例存在高表達，認為P53突變先于食管鱗癌的發展，早期檢測該蛋白可以預測食管鱗癌的發生[24]。董琰濱等[25]基于更大樣本研究發現正常食管粘膜中較少見P53蛋白的表達，而在輕、中、重度不典型增生及原位癌組織中表達依次升高，認為檢測該蛋白可以達到早期診斷的作用。趙朋月等[26]發現在食管鱗癌上皮內瘤變中P53陽性表達率為32.3%，顯著高于正常組織。本研究ESCC上皮內瘤變中，隨著異型增生程度加重，P53陽性率逐漸升高，并且正常組與中、重度不典型增生組差異有統計學意義(P<0.05)，輕度與重度不典型增生組差異亦有統計學意義(P<0.05)，說明P53表達與ESCC癌前病變異型程度相關。

3.3 AR與P53蛋白兩者聯合表達情況與食管鱗癌上皮內瘤變 上述研究表明AR和P53蛋白皆隨著ESCC癌前病變程度加重而呈現表達升高的趨勢。王啟鳴等[27]報道了雌激素受體和P53蛋白陽性率在正常組織、基底細胞過度增生、間變、原位癌和鱗狀細胞癌等病變中依次上升，Logistic回歸分析顯示兩者呈共向性改變。本研究也得出了相似的結論，統計分析表明在中重度不典型增生的食管組織中AR和P53陽性表達程明顯正相關，進一步說明了兩者與ESCC上皮內瘤變的相關性，都隨著異型程度增加而呈現高表達情況。

綜上所述，本研究首次描述了AR和P53蛋白隨著食管鱗癌上皮內瘤變異型程度加重而呈現表達增加的特點，加強對兩者的檢測可能有利于食管鱗癌的早期診斷，便于早期實施適當的干預措施，可以有效改善食管鱗癌的預后，提高患者生活質量，明顯降低社會經濟負擔。