MTHFR基因單核苷酸多態性與冠心病相關性研究

趙唱 賀欣

冠心病(coronary atherosclerotic heart disease)是臨床上心血管內科最常見的疾病之一，發病率較高，由于其發病機制復雜，發病機制目前尚未完全闡明，大量研究發現冠心病發病受外界條件和遺傳基因兩大因素的共同影響，隨著基因測序等分子診斷技術的迅速發展，使得對冠心病個體化診斷和治療成為可能[1]。目前，其病因除了已探明的血脂異常、高血壓、吸煙和糖尿病等傳統的危險因素，冠心病易感基因等分子水平的危險因素研究也逐漸深入[1]。人體中葉酸代謝途徑的關鍵酶之一為亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)。研究顯示，編碼此酶的MTHFR 基因突變可增加冠心病的發病風險，MTHFR基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)與冠心病發病相關。目前，MTHFR基因常見的10個SNP位點有rs1801131、rs1801133、rs4846048、rs3737966、rs1537515、rs34733339、rs2274976、rs3834044、rs3737964和rs4846049。本文綜合考察上述10個SNP位點與冠心病相關性，為冠心病的發生提供更多理論依據，為冠心病的個體化防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月至2020年10月在醫院住院和門診就診的167例冠心病患者作為冠心病組，同時期收集172例健康體檢者作為對照組。冠心病組入組標準：患者均為經冠狀動脈造影結果確診；冠心病組患者之間無親緣關系；患者精神狀態良好，能夠正常交流。冠心病組排除標準：3個月內服用過影響牛胱氨酸(Hcy)水平的葉酸、他汀類藥物患者；患有嚴重自身免疫系統疾病、內分泌功能異常患者；合并腫瘤、血液病患者。對照組入組標準：本研究同時期，冠狀動脈造影證實冠狀動脈無明顯病變,在本院健康體檢者作為對照組。本試驗經醫院倫理委員會批準,受試者均簽署知情同意書同意。

1.2 檢測指標 收集受試者的性別、年齡、吸煙飲酒情況、高血壓病史等一般資料。并采集促凝血3 ml用于檢測Hcy、血糖、總膽固醇等生化指標，同時采集EDTA抗凝血2 ml，用于提取人基因組DNA。

1.3 基因組DNA提取 應用硅膜離心法從抗凝血中提取人白細胞中基因組DNA(德國QIAamp DNA Mini and Blood Mini提取試劑盒，批號：511106)，提取的DNA經微量紫外分光光度檢測濃度和純度合格后，貯存于-80℃冰箱中。

1.4 SNP位點選擇 綜合文獻報道，選擇rs1801133(C677T)和 rs1801131(A1298G)位點，并在國家生物技術信息中心網站(The National Centerfor Biotechnology Information，NCBI；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索MTHFR基因編碼區、5’端調節序列、3’端調節序列等可能降低酶活性的SNP位點,結合千人基因組計劃數據庫中，選擇最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)>0.05的SNP位點，篩選出8個位點，共計研究10個SNP位點。

1.5 MTHFR基因型分型 以提取的受試者基因組DNA為模板，PCR擴增MTHFR基因目的序列，通過測序檢測SNP多態性。50 μl PCR體系如下：PCR緩沖液Mix 25 μl,DNA 2 μl,濃度為10 μl的F、R游引物各1 μl,無RNase水補足至50 μl。PCR溫度：94℃預變性5 min;94℃變性30 s,56℃退火45 s,72℃延伸1 min,40個循環，72℃終延伸7 min;擴增產物用毛細管電泳儀檢測目的條帶并進行DNA測序。

2 結果

2.1 一般資料分析 冠心病組167例，平均年齡(55.16±14.35)歲；對照組172例，平均年齡(53.62±14.95)歲。冠心病組吸煙比例、高血壓比例、空腹血糖、Hcy、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)水平顯著高于對照組(P<0.05)，冠心病組高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較

2.2 Hard-Weinberg 平衡檢驗 通過基因測序得到的10個SNP位點等位基因，采用擬和優度檢驗，分別檢驗2組等位基因觀測值與預期值吻合程度，Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，冠心病組和對照組基因型觀測值[observedheterozygote frequency,O(HET)]與預期值[expected heterozygote frequency,E(HET)]差異均無統計學意義(P>0.05)，表明本研究中167例冠心病患者和172例健康體檢者處于Hard-Weinberg 平衡狀態，10個SNP位點可以入選本研究。見表2。

表2 各SNP位點Hardy-Weinberg檢驗

2.3 MTHFR基因10 個SNP與冠心病單位點關聯分析 在rs1801133位點，冠心病組T等位基因頻率顯著高于對照組(χ2=6.409，P=0.011)，基因型分布差異有統計學意義(χ2=8.054，P=0.018),rs4846049位點冠心病組T等位基因頻率顯著高于對照組(χ2=4.212，P=0.040)，基因型分布差異有統計學意義(χ2=7.019，P=0.030)，其余位點rs4846048、rs3737966、rs1537515、rs34733339、rs2274976、rs1801131、rs3834044和rs37379642組間等位基因頻率和基因型分布差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 冠心病組與對照組等位基因頻率比較 例(%)

2.4 連鎖不平衡分析 MTHFR基因10 個SNP位點應用Haploview軟件進行連鎖不平衡分析，分析結果顯示，10 個SNP位點存在連鎖不平衡現象，出現2個區塊(Block)，分別為由rs4846048、rs3737966、rs1537515組成的區塊1(Block1)和由rs4846049、rs2274976、rs1801131、rs1801133組成的區塊2(Block2)各位點之間存在明顯連鎖不平衡現象，其 D’均>0.9 且 r2均>1/3。Haploview軟件進一步分析顯示，10個SNP位點共構成7種單倍型，分別為區塊1構成的GCC、ACC、GTA單倍型和區塊2構成的TGAT、GAAC、GACC、GGAC。見圖1、2。

圖1 MTHFR 基因SNP位點連鎖不平衡圖(D’值);圖上部是所選SNP在基因上的定位，下部是10個SNP位點的Haploview 連鎖不平衡圖

2.5 基因位點單倍體型與冠心病Logistic回歸分析 單倍型Logistic回歸分析以是否患有冠心病為因變量，以性別、年齡、空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇、HDL、LDL、Hcy、BMI、高血壓、吸煙史、飲酒史、單倍型作為自變量，建立Logistic回歸模型。Logistic回歸分析結果顯示，Block2中的TGAT單倍型冠心病組與對照組存在顯著差異,TGAT單倍型患冠心病風險是GGAC單倍型的2.512倍。TGAT單倍型(P=0.030)、空腹血糖(P<0.001)、三酰甘油(P=0.005)、HDL-C(P=0.005)、LDL-C(P=0.001)、Hcy(P=0.001)、高血壓(P=0.014)是患冠心病的獨立危險因素。見表4。

圖2 MTHFR 基因位點連鎖不平衡圖(r2值);圖上部是所選SNP在基因上的定位，下部是10個SNP位點的Haploview 連鎖不平衡圖

表4 基因位點單倍體型與冠心病Logistic回歸分析

3 討論

冠心病作為一種常見的心血管疾病，其病因復雜，相關研究探索了遺傳因素對冠心病患病影響[2,3]。但不同種族的受試者冠心病與遺傳易感位點相關性結論并不一致[4-6]。MTHFR 基因定位于人基因組1p36.3，由10 個內含子和11個外顯子組成，其基因大小為2.2kb，編碼的的蛋白為亞甲基四氫葉酸還原酶，此酶是葉酸代謝途徑的關鍵酶，當該酶發生突變時，其酶活性降低，影響Hcy復甲基化代謝途徑。MTHFR 基因變異程度較高，常見的突變類型有6種錯義突變、1種 5’末端剪接位點處的突變和 1 種無義突變。

MTHFR基因常見的SNP位點有 rs1801133、rs1801131、rs4846048、rs4846049等，而目前MTHFR基因SNP位點與冠心病相關性研究主要集中于rs18011331和rs1801133兩個位點。既往研究發現MTHFR rs1801133多態性對漢族MTHFR酶活性及冠心病的影響最大[7-9]，相關研究顯示，不同種族的rs1801133等位基因分布具有差異性[10,11]。rs1801133位點位于MTHFR基因第4 外顯子，在基因序列上T突變為C，纈氨酸突變為丙氨酸，并產生Hinf I 酶切位點，改變亞甲基四氫葉酸還原酶活性降低,人體蛋氨酸循環障礙,導致高Hcy血癥，而高Hcy 血癥被認為是心腦血管疾病的獨立危險因素[12-14]。本研究結果顯示，冠心病組T 等位基因頻率為54.49%，顯著高于對照組的44.77%，且2組不同基因型分布具有顯著差異，這與湖南省和廣西省等我國南方漢族人群中相關研究[15,16]結論一致。

對于MTHFR基因另一常見SNP位點rs1801131，研究結論并不一致。李亞萍等[17]研究顯示，河南地區漢族人群中rs1801131位點T等位基因攜帶者患靜脈血栓的風險更高。但周麗萍等[18]研究認為，CC基因型及C等位基因頻率顯著高于健康對照組。番云華等[19]研究結果顯示MTHFRA1298C(rs1801131)與高同型半胱氨酸血癥無相關性。本研究結果顯示,rs1801131位點等位基因頻率和3種基因型分布在冠心病組與對照組中差異均無統計學意義(P>0.05)。

對于其他6個SNP位點，定位于MTHFR基因3’ UTR的rs4846049位點與冠心病相關性研究較少，侯榮耀等[20]研究表明此位點與腦血管疾病相關，攜帶T等位基因受試者腦血管疾病發病風險顯著增高，TT基因型也使缺血性卒中發病風險顯著增高，本研究中此位點冠心病組T 等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.05)，基因型分布差異有統計學意義(P<0.05)，表明本地區rs4846049位點是冠心病易感性位點。

rs2274976位點的突變位點為G1793A，此位點對于冠心病影響尚存在不同觀點，李振華等[21]研究顯示，MTHFR基因G1793A多態性與血清Hcy水平有相關性,血清Hcy水平AA突變型顯著高于GG野生型，但施翎等[22]研究顯示，AA型突變型未出現血漿Hcy水平升高的風險。本研究顯示，冠心病組與對照組G1793A等位基因和基因型分布無差異。而rs4846048、rs3737966、rs1537515、rs34733339、rs3834044和rs3737964冠心病組與對照組等位基因和基因型分布差異均無統計學意義(P>0.05)。

對10個SNP位點進一步的單倍型分析顯示，分別為由rs4846048、rs3737966、rs1537515組成的區塊1和由rs4846049、rs2274976、rs1801131、rs1801133組成的區塊2，各位點之間存在明顯連鎖不平衡現象。10個SNP位點共構成7種單倍型，分別為區塊1構成的GC、AC、GT單倍型和區塊2構成的GACT、GGAC、GAAT、AGAC。Logistic回歸分析顯示，區塊1構成的3種單倍型并不是冠心病的危險因素，而區塊2構成的單倍型GACT，是發生冠心病的危險性單倍型，TGAT單倍型患冠心病風險是AGAC單倍型的2.512倍。目前筆者發現MTHFR基因rs1801133等單一的SNP與冠心病相關性研究較多，但MTHFR基因多SNP位點構成的單倍型與冠心病相關性報道較少，隨著分子生物學和高通量基因測序等技術的進步，長片段基因測序成本將大大降低，更有利于多位點的單倍型研究。

本研究結論還需通過擴大樣本量、對多態性位點進一步行相關功能研究、選擇不同人群及種族，排除其他干擾因素，進一步控制偏倚將會獲取更客觀、確鑿的論證，為探索MTHFR基因 SNP對冠心病的影響，早期進行MTHFR基因多SNP位點檢測，為指導冠心病個體化治療提供依據，為冠心病的預防與治療提供新方向。