miR-370調控ISG15表達對喉癌細胞增殖、遷移的影響

劉洋君 李麗 陸曉丹

喉癌的發病率占頭頸部癌的第二位，患者的5年生存率較低，復發和轉移是喉癌患者死亡的主要原因，因此研究喉癌細胞的遷移與轉移機制具有重要意義[1,2]。微小RNA-370(MicroRNA-370，miR-370)是一種腫瘤抑制基因，可參與調控結腸癌、膠質瘤等多種腫瘤細胞的增殖、遷移等[3,4]。Shen等[5]研究表明，miR-370在結腸癌中下調表達，miR-370可靶向MDM4抑制結腸腫瘤的生長。干擾素刺激基因15(interferon stimulating gene 15，ISG15)是一種由Ⅰ型干擾素誘導的蛋白，屬于泛素樣蛋白超家族，其在多種惡性腫瘤中高度表達[6]。然而筆者發現miR-370與ISG15在喉癌細胞中的作用機制尚不清楚，因此，本研究通過探索過表達miR-370對喉癌細胞(LSC-1)增殖、遷移及侵襲的影響及其對ISG15的調控作用，以期尋找喉癌治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人喉癌細胞LSC-1購于中國科學院細胞庫；DMEM培養基(貨號：SH40007.01)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(貨號：F8245-100)、DMSO(貨號：D2650)購自Solarbio公司；miR-370過表達質粒(miR-370 mimics)及其陰性對照(miR-NC)、ISG15過表達質粒(ISG15)及其空載質粒(pcDNA)、抑制ISG15表達(si-ISG15)及其陰性對照(si-NC)質粒購自上海斯信生物科技有限公司；miR-370、ISG15、U6、GAPDH引物序列由上海吉瑪制藥有限公司設計合成；Matrigel膠(貨號：356234)購自美國BD公司，CCK-8試劑盒(貨號：C0037)、RIPA細胞裂解液(貨號：P0013B)購自上海碧云天生物技術有限公司；Lipofectamine 2000(貨號：11668-027)、Trizol購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號：E1920)購自Promega公司；兔抗人ISG15(貨號：ab227541)、MMP-2(貨號：ab92536)、MMP-9(貨號：ab228402)抗體購自英國Abcam公司。M2型全波長酶標儀購自美國MD公司；XDS-1B型顯微鏡購自上海光學儀器廠；ABI 7500熒光定量PCR儀購自Thermofisher。

1.2 標本來源 喉癌組織與癌旁組織標本各31例，來源于2017年7月至2020年10月在我院行手術治療的喉癌患者，年齡37～73歲，平均年齡(55.70±9.30)歲；手術過程中取喉癌組織與癌旁組織；分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期12例，Ⅲ期7例，Ⅳ期3例。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR(real-time quantification PCR，RT-qPCR)實驗檢測miR-370和ISG15 mRNA水平:采用RT-qPCR法檢測喉癌組織與癌旁組織miR-370和ISG15 mRNA相對表達量，分別以U6、GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算miR-370和ISG15 mRNA相對表達量。miR-370上游引物(5’-3’)：TGCTGGGGTGGAACCT，下游引物(5’-3’)：GAACATGTCTGCGTATCTC；U6上游引物(5’-3’)：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物(5’-3’)：CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT；ISG15上游引物(5’-3’)：CTCTGAGCATCCTGGTGAGGAA，下游引物(5’-3’)：AAGGTCAGCCAGAACAGGTCGT；GAPDH上游引物(5’-3’)：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，下游引物(5’-3’)：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。

1.3.2 細胞培養及轉染:復蘇培養人喉癌細胞LSC-1，將LSC-1細胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養基進行傳代培養，待細胞生長至對數期時，取質粒按照Lipofectamine 2000說明書轉染LSC-1細胞，將LSC-1細胞分為對照組、miR-NC組、miR-370 mimics組、si-NC組、si-ISG15組、miR-370 mimics+pcDNA組和miR-370 mimics+ISG15組，細胞轉染6 h后更換新鮮DMEM培養液繼續培養用于后續實驗。檢測LSC-1細胞miR-370表達和ISG15蛋白表達以驗證轉染效率。

1.3.3 雙熒光素酶報告基因檢測實驗:根據生物信息學軟件預測顯示，miR-370與ISG15 3’UTR有結合區域，ISG15可能是miR-370的靶基因，根據二者結合序列區域，分別構建野生型ISG15-3’UTR-WT和突變型ISG15-3’UTR-MUT質粒，取上述質粒分別與miR-370 mimics、miR-NC共轉染LSC-1細胞24 h，分為ISG15-3’UTR-WT+miR-NC組、ISG15-3’UTR-WT+miR-370 mimics組、ISG15-3’UTR-MUT+miR-370 mimics組和ISG15-3’UTR-MUT+miR-NC組，根據雙熒光素酶報告基因試劑盒測定熒光素酶活性。

1.3.4 細胞計數試劑盒8(CCK-8)法檢測細胞增殖:轉染后的各組LSC-1細胞接種至96孔板中，分別培養24、48、72 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37℃繼續培養2 h后，在酶標儀450 nm處檢測吸光度(OD)值，繪制細胞生長曲線。

1.3.5 Transwell小室檢測細胞遷移與侵襲:細胞遷移實驗：使用無血清的DMEM培養基將各組LSC-1細胞制備成4×105個/ml的細胞懸液，Transwell小室上室加入200 μl細胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃含5% CO2培養箱培養24 h 后，下室用4%多聚甲醛固定20 min，0.5%結晶紫染色10 min，倒置顯微鏡觀察，隨機觀察6個視野的穿過微孔膜細胞數。細胞侵襲實驗：Matrigel基質膠溶解后均勻的鋪于Transwell小室上室，調整各組LSC-1細胞為4×105個/ml的細胞懸液，Transwell小室加入200 μl細胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基，培養24 h后，其余步驟同遷移實驗。

1.3.6 免疫印跡法(western blotting，WB)檢測ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達:轉染后LSC-1細胞在6孔板培養48 h，加入200 μl RIPA細胞裂解液與蛋白酶抑制劑的混合液裂解30min，離心取上清液，BCA法檢測蛋白濃度，取30 μg蛋白進行電泳，轉膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入稀釋后的ISG15、MMP-2、MMP-9抗體和β-actin(1∶500)抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌，添加相應二抗室溫孵育2 h，凝膠成像系統成像，使用Quantity One軟件分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 miR-370、ISG15在喉癌組織中的表達 癌旁組織中miR-370表達水平為(1.05±0.12)，ISG15 mRNA表達水平為(1.01±0.14)；喉癌組織中miR-370表達水平為(0.43±0.07)，ISG15 mRNA表達水平為(2.51±0.47)，癌旁組織與喉癌組織miR-370、ISG15 mRNA表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 miR-370與ISG15靶向關系 數據庫預測發現，miR-370與ISG15 mRNA 3’UTR區有結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miR-370 mimics與野生型ISG15質粒共轉染LSC-1細胞后，熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。表明miR-370與ISG15存在靶向關系。見表1，圖1。

表1 雙熒光素酶報告基因檢測結果

圖1 miR-370與ISG15 mRNA結合位點預測結果

2.3 過表達miR-370對LSC-1細胞ISG15表達及增殖、遷移與侵襲的影響 轉染miR-370 mimics后，與對照組和miR-NC組相比，miR-370 mimics組LSC-1細胞增殖、遷移、侵襲能力與ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-370表達顯著升高(P<0.05)。表明過表達miR-370可顯著抑制LSC-1細胞增殖、遷移與侵襲。見圖2，表2。

圖2 過表達miR-370對LSC-1細胞ISG15表達及增殖、遷移與侵襲的影響；A 過表達miR-370對LSC-1細胞增殖的影響；B 3組LSC-1細胞ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達電泳圖(1 對照組；2 miR-NC組；3 miR-370 mimics組)；C 3組LSC-1細胞遷移與侵襲(結晶紫染色×400)

表2 過表達miR-370對LSC-1細胞ISG15蛋白表達、遷移與侵襲的影響

2.4 抑制ISG15表達對LSC-1細胞增殖、遷移與侵襲的影響 LSC-1細胞轉染si-ISG15質粒后，與對照組和si-NC組相比，si-ISG15組LSC-1細胞增殖、遷移、侵襲能力和ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，表明下調ISG15表達可顯著抑制LSC-1細胞增殖、遷移和侵襲。見表3，圖3。

表3 抑制ISG15表達對LSC-1細胞遷移與侵襲的影響

圖3 抑制ISG15表達對LSC-1細胞增殖、遷移與侵襲的影響；A 抑制ISG15表達對LSC-1細胞增殖的影響；B 3組LSC-1細胞ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達電泳圖(1 對照組；2 si-NC組；3 si-ISG15組)；C 3組LSC-1細胞遷移與侵襲圖(結晶紫染色×400)

2.5 過表達ISG15可逆轉過表達miR-370對LSC-1細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用 將ISG15過表達質粒與miR-370 mimics質粒共轉染LSC-1細胞后，LSC-1細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著升高，主要表現為ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。表明過表達ISG15可部分逆轉過表達miR-370對LSC-1細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用。見圖4，表4。

表4 過表達miR-370基礎上過表達ISG15對LSC-1細胞遷移與侵襲的影響

圖4 過表達ISG15可逆轉過表達miR-370對LSC-1細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用;A 過表達miR-370基礎上過表達ISG15對LSC-1細胞增殖的影響; B 3組LSC-1細胞ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達電泳圖(1 miR-370 mimics組；2 miR-370 mimics+pcDNA組；3 miR-370 mimics+ISG15組);C 3組LSC-1細胞遷移與侵襲圖(結晶紫染色×400)

3 討論

多項報道顯示，miRNAs參與調節喉癌細胞增殖、凋亡和腫瘤細胞耐藥性等過程，與喉癌的發生發展密切相關，miR-370為抑癌基因，其異常表達與卵巢癌、乳腺癌、膠質瘤等腫瘤的發生有關[7-9]。有研究顯示，喉鱗狀細胞癌(LSCC)組織中miR-370表達下調，miR-370可能靶向FoxM1抑制Hep2細胞增殖[10]。本研究結果顯示，喉癌組織中LSC-1中miR-370表達下調，與先前報道[7,8]一致。本研究將miR-370過表達質粒轉染LSC-1細胞發現，與對照組和miR-NC組相比，miR-370 mimics組LSC-1細胞增殖、遷移、侵襲能力與MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低，表明過表達miR-370可顯著抑制LSC-1細胞增殖、遷移與侵襲，提示miR-370可能在喉癌中發揮抑癌作用。此外，研究顯示，miR-370還可抑制胃癌、肝癌等腫瘤細胞的遷移與侵襲[9]，與本研究結果一致。錢麗麗等[10]研究表明，在腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導的肝癌細胞中，miR-370可靶向叉頭框基因(Fox)抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNAs通過對下游靶蛋白的調控而參與調控腫瘤細胞的增殖與遷移是腫瘤生成與轉移的重要基礎，本研究通過生物信息學軟件預測發現，miR-370與ISG15有結合位點。ISG15作為一個IFN刺激蛋白，其單體及共價修飾蛋白在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，在多數腫瘤中，ISG15上調表達，且與腫瘤的惡性程度和不良預后有關[11,12]。研究表明，在胰腺導管腺癌(PDAC)細胞中，敲低ISG15表達，可抑制細胞增殖和集落形成，導致CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞數量增加和胰腺腫瘤生長減少[13]。本研究結果顯示，LSC-1細胞中轉染si-ISG15質粒以下調ISG15表達后，LSC-1細胞增殖、遷移和侵襲能力和MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低，表明下調ISG15表達可顯著抑制LSC-1細胞增殖、遷移和侵襲。另有研究顯示，ISG15在結腸癌組織中高表達，ISG15上調與結腸癌患者預后不良密切相關，ISG15表達上調可促進結腸癌細胞的體外遷移和增殖，而ISG15表達下調可抑制結腸癌細胞的增殖和轉移，此外，下調ISG15可以增強曲美替尼對結腸癌細胞的抗癌作用[14]。本研究經過雙熒光素酶報告基因檢測顯示，miR-370與ISG15存在靶向關系。另外本研究也顯示，在LSC-1細胞中，miR-370的上調可抑制ISG15表達，且過表達ISG15可部分逆轉過表達miR-370對LSC-1細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用。Liu等[15]研究表明，miR-370可靶向調控ISG15表達，調控肝癌細胞對IFN-α的敏感性，也證實了miR-370與ISG15存在靶向關系。以上這些結果表明miR-370可通過靶向抑制ISG15表達，影響LSC-1細胞增殖、遷移與侵襲。

綜上所述，過表達miR-370可通過靶向抑制ISG15表達而抑制人喉癌細胞的增殖、遷移及侵襲，本研究僅對相關機制進行了初步研究，具體作用機制有待進一步研究。