高溫型抗病平菇新品種選育*

劉 萌，劉昆昂，劉振國，馬 宏，張根偉，胡向東，趙寶華**

（1．河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024；2．河北省科學(xué)院生物研究所，河北 石家莊 050081）

平菇隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 層菌綱（Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 側(cè)耳科（Plenrotaceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus）[1]。目前已知的側(cè)耳種類有100多種。平菇對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，分布廣泛，成為我國廣泛栽培的食用菌，因其菌蓋似貝殼或舌狀，故又稱耗菌，也稱為北風(fēng)菌、凍菌、天花蕈等[2]。

平菇的傳統(tǒng)生產(chǎn)中，多數(shù)平菇品種為低溫型和中溫型，可用于夏季栽培的高溫型平菇相對(duì)較少，且部分高溫型菌株對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)能力較弱且并非真正的耐高溫品種，其出菇溫度無法滿足夏季的栽培要求。所以，高溫型菌株尤其是耐高溫菌株的缺乏是制約平菇夏季生產(chǎn)的現(xiàn)實(shí)問題[3]。雖然可供平菇育種選擇的方法包括選擇、雜交和基因轉(zhuǎn)化等[4-6]，但以食用為目的的栽培品種平菇選育方法方面需要慎重選擇。歐洲的現(xiàn)行法規(guī)（European Directive 2001/18/CE） 認(rèn)為遺傳轉(zhuǎn)化和誘變處理產(chǎn)生的菌株不符合“自然或安全過程”原則[7]。因此，將親本單核菌株交配融合產(chǎn)生新雙核菌絲體的雜交育種方式成為選育平菇優(yōu)良菌株的首選方法[6-8]。篩選雜交菌株時(shí)，為提高篩選效率，直接將可親和組合置于高溫出菇環(huán)境，將無法在高溫出菇的組合淘汰。期望在育種研究中選育出具有抗雜菌污染、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的高溫型平菇菌株，提高平菇生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試平菇菌株科佳1號(hào)、江都71均來源于河北省科學(xué)院生物研究所保藏。

科佳1號(hào)為廣溫型平菇菌株，菌絲生長溫度為5℃～35℃，最適為22℃～25℃；出菇溫度為4℃～28℃，最適為6℃～25℃；產(chǎn)量高于江都71；對(duì)高溫耐受能力弱于江都71[9]。試驗(yàn)中科佳1號(hào)單孢菌株編號(hào)以A表示。

江都71為夏季主栽的高溫平菇品種，出菇溫度為12℃～36℃；產(chǎn)量低于科佳1號(hào)；對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)于科佳1號(hào)[10]。單孢菌株編號(hào)以JD表示。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g，水1 L（制備固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂12 g）。

培養(yǎng)料配方：棉籽殼93%、麥麩5%、石灰2%，含水量65%。

1.3 平菇單核菌絲的制備

將供試菌株科佳1號(hào)和江都71轉(zhuǎn)接于PDA平板上，置于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲長滿后，接種到菌袋（培養(yǎng)料）中，各菌株接種15袋，置于25℃菇房中培養(yǎng)。待菌袋中的菌絲長滿形成原基后，進(jìn)行出菇管理。選擇菇型完整，大小適中，無病蟲害，約八成熟的子實(shí)體，放入平皿中收集孢子。向上述收集孢子的平板內(nèi)加入少量滅菌的蒸餾水充分混勻后，吸取1 mL移入試管內(nèi)，混勻后進(jìn)行稀釋，稀釋梯度為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，進(jìn)行單孢菌株分離[11]。然后每個(gè)梯度吸取0．1 mL孢子懸液移入PDA平皿內(nèi)涂布均勻，設(shè)置5個(gè)重復(fù)，25℃培養(yǎng)，挑取單菌落移至新的PDA平皿上25℃培養(yǎng)。

1.4 平菇耐高溫新品種選育

挑選上述單孢分離的2個(gè)親本的單核菌絲，兩兩配對(duì)組合分別接種于同一PDA平皿中，2個(gè)接種塊間距2 cm，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至菌絲接觸時(shí)，將交界處的菌絲接入PDA平皿中培養(yǎng)。當(dāng)菌絲生長至半徑3 cm左右時(shí)，用顯微鏡觀察是否有鎖狀聯(lián)合，若有鎖狀聯(lián)合則為雜交成功[12]。將鏡檢選出的雜交菌株接入栽培袋中25℃培養(yǎng)至滿袋，后置于30℃和35℃培養(yǎng)箱中交替培養(yǎng)，選擇能在此溫差下出菇的雜交子進(jìn)行組織分離。

1.5 高溫型平菇菌絲階段初篩

1．5．1 不同溫度下平菇雜交子菌絲生長速度測定

將上述試驗(yàn)篩選的平菇雜交子接入裝有35 mL PDA培養(yǎng)基、直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)至滿皿后，用直徑為0．5 cm的打孔器打孔制備菌餅。將菌餅接入定量PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于30℃、35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。3天后劃線，記錄菌絲生長天數(shù)和菌落半徑，計(jì)算菌絲生長速度。菌絲生長速度（V，%）的計(jì)算公式為：

式中：S為菌落半徑（cm）；D為菌絲生長天數(shù)（d）。

1．5．2 平菇雜交子抗木霉能力測定

分別將篩選得到的平菇雜交子和木霉接入裝有35 mL PDA培養(yǎng)基、直徑為9 cm的平板中，25℃培養(yǎng)至滿皿后，用直徑為0．5 cm的打孔器打孔制備菌餅。將菌餅接種到距離中心1．75 cm處，25℃培養(yǎng)3 d，后對(duì)稱接入木霉菌餅，25℃培養(yǎng)3 d。觀察、記錄菌絲生長及拮抗情況，測量拮抗線的寬度、菌絲生長半徑，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.6 高溫型平菇雜交子與親本的親和性試驗(yàn)

將篩選得到的平菇雜交子經(jīng)平皿培養(yǎng)活化后，用直徑5 mm打孔器制備供試菌株菌的菌餅接種于PDA培養(yǎng)皿（直徑9 cm）上。每個(gè)平皿上分別接種雜交菌株和親本菌株，菌餅分布呈三角形，菌餅間兩兩相距2 cm左右。接種完成后用封口膜將平皿封口，置于25℃生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7 d左右觀察菌絲生長交界處拮抗反應(yīng)情況，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.7 高溫型平菇雜交子的分子鑒定

1.7.1 高溫型平菇雜交子的DNA提取

使用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取選育出的高溫型平菇雜交子的基因組DNA。

1.7.2 高溫型平菇雜交子的ISSR鑒定

參照食用菌菌種真實(shí)性鑒定ISSR法對(duì)供試菌株進(jìn)行鑒定[13]。所用引物序列見表1。

表1 ISSR分析所需引物序列Tab.1 Primer sequences of ISSR analysis

PCR 反應(yīng)的總體積為 20 μL：10 μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye （GenStsr），7 μL ddH2O，2 μL引物，1 μL模板DNA（所有待測DNA樣品均將濃度統(tǒng)一為10 ng·μL-1）。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，參考各條引物的Tm值，在Tm值基礎(chǔ)上溫度增加5℃復(fù)性45 s，72℃延伸2 min，設(shè)置35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶以0、1統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫，在相同遷移位置上（相同分子量片斷），有擴(kuò)增帶記為1，無擴(kuò)增帶記為0，以2次試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。所有獲得的數(shù)據(jù)建立一個(gè)二進(jìn)制矩陣數(shù)據(jù)庫，借助統(tǒng)計(jì)軟件包NYSYS-PC 2.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用 UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic averages） 方法進(jìn)行 Jaccard’s coefficient的計(jì)算和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建[14]。

1.7.3 高溫型平菇雜交子的ITS鑒定

使用真菌ITS序列通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 對(duì)篩選出的高溫型平菇雜交子進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，PCR反應(yīng)體系：5 μL 2× EasyTaq PCR SuperMix（TRANS）、正反向引物分別加入2.5 μL、2.5 μL DNA模板，用水補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。使用MEGA 6軟件進(jìn)行序列比對(duì)，以鄰位連接法（neighbor-joining method，NJ） 進(jìn)行聚類分析，Bootstrap值為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫平菇品種的選育

從栽培試驗(yàn)所得子實(shí)體中挑選大小合適、無蟲害、干凈、完整的子實(shí)體，經(jīng)孢子稀釋培養(yǎng)，平菇雜交子的鏡檢結(jié)果見圖1。

圖1 平菇雜交子的鏡檢Fig．1 Microscopic examination of Pleurotus ostreatus hybrids

參照?qǐng)D1鏡檢，去除生長緩慢、菌絲稀疏和菌落生長不規(guī)則等不良單孢菌株后，科佳1號(hào)共獲得11個(gè)優(yōu)良單孢菌株，江都71共獲得14個(gè)優(yōu)良單孢菌株。將兩親本單孢菌株兩兩配對(duì)雜交，共154個(gè)組合，鏡檢確定具有鎖狀聯(lián)合的菌株22個(gè)。

高溫環(huán)境平菇雜交子的出菇情況見圖2。

圖2 高溫環(huán)境下平菇雜交子的出菇情況Fig．2 Fruiting situation of Pleurotus ostreatus hybrids under high temperature environment

如圖2所示，22個(gè)菌株中有8個(gè)菌株可在30℃和35℃高溫環(huán)境出菇，將這8個(gè)菌株分別標(biāo)號(hào)為PZ1、PZ2、PZ3、PZ4、PZ5、PZ6、PZ7、PZ8。其中PZ1、PZ2、PZ3、PZ4、PZ6為淺色品種，其余為深色品種；PZ1、PZ4、PZ8菌柄較短，其余菌柄較長；PZ3、PZ6子實(shí)體單生，其余叢生。對(duì)此8個(gè)菌株進(jìn)行組織分離，為后續(xù)試驗(yàn)提供供試純化菌株。

2.2 不同溫度下平菇雜交子菌絲生長速度

篩選出的平菇雜交子及親本菌株在溫度為30℃和35℃條件下的生長速度見表2。

表2 平菇雜交子在30℃和35℃條件下菌絲的生長速度Tab．2 Mycelial growth rate of Pleurotus ostreatus hybrids at 30℃and 35℃

由表2所示，Duncan多重比較分析發(fā)現(xiàn)供試菌株30℃和35℃時(shí)生長速度均有顯著差異。

30℃時(shí)，菌株P(guān)Z1的菌絲平均生長速度最快，快于2個(gè)親本，且差異顯著；菌株P(guān)Z1、PZ2、PZ3、PZ6、PZ7菌絲平均生長速度均快于2個(gè)親本，其中菌株P(guān)Z1、PZ2、PZ7菌絲平均生長速度均明顯快于2個(gè)親本，差異顯著，但3個(gè)菌株間差異不顯著；菌株P(guān)Z3、PZ6菌絲平均生長速度雖快于2個(gè)親本，但均與江都71差異不顯著，PZ6菌絲平均生長速度顯著高于科佳1號(hào)。

在35℃時(shí)菌株P(guān)Z1、PZ3、PZ5、PZ6菌絲平均生長速度快于2個(gè)親本，其中PZ3、PZ6明顯快于2個(gè)親本，差異顯著；PZ1、PZ5菌絲平均生長速度雖顯著高于江都71，但與科佳1號(hào)相比不顯著，根據(jù)顯著性結(jié)果分析與科佳1號(hào)可歸為一類。

2.3 平菇雜交子菌絲抗木霉能力

木霉（Trichoderma spp．）會(huì)影響其平菇的生長，平菇生長的不同階段都會(huì)受到木霉危害，影響其產(chǎn)量，因此要篩選出抗木霉能力強(qiáng)的優(yōu)良品種至關(guān)重要，平菇親本與雜交菌株的抗木霉能力測定結(jié)果見表3。

表3 平菇親本與雜交菌株抗木霉能力測定Tab．3 Determination of resistance to Trichoderma spp．of Pleurotus ostreatus parent and hybrid strain

由表3可知，不同雜交菌株對(duì)木霉的拮抗能力不同，大部分的菌株都有抗木霉的能力；拮抗線的寬度越窄，說明抗木霉能力越強(qiáng)。PZ2、PZ3、PZ4、PZ5和PZ8的抗木霉能力強(qiáng)；PZ1的抗木霉能力介于2個(gè)親本之間，強(qiáng)于江都71，但弱于科佳1號(hào)；PZ5的抗木霉能力最強(qiáng)，但與木霉接觸后菌絲生長能力弱于親本和其他雜交菌株。

2.4 平菇雜交子與親本菌株的拮抗試驗(yàn)

選育出的平菇雜交子與親本的拮抗反應(yīng)見圖3。

圖3 平菇雜交子與親本的親和性Fig．3 Compatibility between Pleurotus ostreatus hybrids and their parents

如圖3所示，各雜交菌株均與雙親表現(xiàn)出明顯的抗性，其中PZ2、PZ4與科佳1號(hào)拮抗明顯，與江都71拮抗現(xiàn)象不明顯。

2.5 平菇雜交子ISSR分析

用表1中的40條核苷酸引物對(duì)親本及雜交菌株菌絲進(jìn)行擴(kuò)增。其中P14、P16、P19、ISSR1、ISSR2、ISSR3、ISSR4、ISSR5、SSRI6、ISSR7、ISSR8、ISSR9、ISSR10、ISSR11、ISSR12，15 條引物能擴(kuò)增出條帶，條帶清晰且具多態(tài)性的帶譜，擴(kuò)增片段大小在100 bp～5 000 bp。每條引物擴(kuò)增的DNA片段條帶數(shù)在1條～7條，15條引物擴(kuò)增的平均條帶數(shù)為 13．2 條。

15條引物共擴(kuò)增DNA片段198條，差異性條帶178條，多態(tài)性片段占總數(shù)的89．9%，證明篩選的引物對(duì)平菇菌株DNA擴(kuò)增的條帶多態(tài)性豐富、穩(wěn)定，可以用于親緣關(guān)系的分析。重復(fù)序列ISSR指紋分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

圖4 基于供試菌株的重復(fù)序列ISSR指紋分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．4 Phylogenetic tree constructed based on repeated sequence ISSR fingerprinting of test strains

由圖4可以看出，供試菌株的相關(guān)系數(shù)在0．48～0．86。在0．64水平左右，可以聚為3大類。其中，江都 71、PZ1、PZ2、PZ4、PZ5、PZ6、PZ7、PZ8 聚為第一類，PZ3聚為第二類，科佳1號(hào)為第三類。基本可以得出在雜交種與親本的親緣關(guān)系中，江都71與所有的雜交子在親緣關(guān)系上較科佳1號(hào)更近；PZ4、PZ5、PZ6、PZ7、PZ8的關(guān)系較其他菌株更近；PZ1和PZ2與大部分雜交子相比親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.6 平菇雜交子ITS序列分析

基于ITS序列構(gòu)建的側(cè)耳屬系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

圖5 基于ITS序列采用鄰位連接法獲得的側(cè)耳屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Pleurotus phylogenetic tree obtained by neighbor-joining method based on ITS sequences

如圖5所示，10株菌株可以分成2個(gè)大分枝，菌株科佳1號(hào)較其他菌株差異較大；而在其余的9株菌株組成的另一枝中，菌株江都71和菌株P(guān)Z1和菌株P(guān)Z2、PZ3、PZ4分成2枝，說明這2個(gè)菌株較其余菌株其ITS區(qū)差異性較高，而菌株江都71和菌株P(guān)Z1親緣關(guān)系較近。該系統(tǒng)發(fā)育樹雖與ISSR結(jié)果不同但也驗(yàn)證了雜交子代與親本中的江都71親緣關(guān)系更近。

3 討論與結(jié)論

為提高育種效率，對(duì)親本菌株進(jìn)行兩兩組合雜交后在30℃和35℃的高溫環(huán)境進(jìn)行出菇試驗(yàn)，排除大量不符合育種目標(biāo)的雜交菌株，獲得8個(gè)可在高溫環(huán)境下出菇的菌株。結(jié)果表明，在篩選高溫菌株時(shí)，直接將雜交試驗(yàn)菌株置于高溫環(huán)境進(jìn)行出菇驗(yàn)證，可大量減少后期篩選鑒定工作量，大幅提高育種效率。后期在對(duì)雜交菌株與親本的菌絲進(jìn)行性能比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有可在高溫下出菇的菌株在高溫條件下酶活性、對(duì)木霉抗性、生長速度等方面均優(yōu)于親本。綜合比較雜交菌株和親本菌絲在高溫環(huán)境下的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)PZ5在菌絲生長速度明顯弱于親本，但隨溫度升高其他指標(biāo)大幅度提高，且增長比率較高，說明其擁有很高的后期提升潛力，可進(jìn)一步與親本進(jìn)行雜交改良。雜交菌株與親本的菇農(nóng)藝性狀比較結(jié)果表明，PZ1和PZ7在實(shí)驗(yàn)室條件下栽培出菇的子實(shí)體外觀明顯優(yōu)于親本。上述試驗(yàn)證明了在雜交育種選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的親本，有可能獲得與親本相比更優(yōu)秀的雜交子代。