雷米普利通過激活ERK1/2-Cx43信號通路降低SHR大鼠的血壓

趙 亮， 魏 童

(新疆醫科大學第五附屬醫院, 新疆 烏魯木齊 830011)

高血壓是心臟病、腦血管疾病和腎臟疾病最重要的危險因素，嚴重影響現代人類生活質量[1]。高血壓的血管病變(如損傷、氧化應激和炎癥)可導致血管收縮壓升高[2]。血管緊張素II(Angiotensin,AngII)是一種強大的促炎和血管收縮因子，可誘導平滑肌細胞(SMCs)表型轉化并參與血管重塑。雷米普利(ramipril,RMP)是一種關鍵的血管緊張素的抑制劑，不僅抑制血管緊張素I向血管緊張素Ⅱ的轉化，還與內源性緩激肽的積累有關，導致內皮依賴性血管舒張[3]。然而，目前仍缺乏關于RMP對自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)血壓的影響和調控機制的研究。縫隙連接(gap junction,GJ)是一種典型的存在于相鄰細胞之間的膜通道結構，其基本單位稱為連接蛋白(connexins,Cxs)。電或化學信號可以通過Cxs從血管內皮細胞進入到血管平滑肌細胞，進一步誘導鈣依賴性鉀通道的激活，使細胞膜超極化，引起血管舒張。目前已鑒定出21種Cxs，其中Cx43的表達與高血壓關系最為密切[4]。在血管平滑肌細胞和血管內皮細胞中，細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)的激活促進Cx43的磷酸化。另外，已知ERK1/2在血管內皮細胞增殖、遷移、分化和細胞周期中發揮重要調控作用，ERK1/2的磷酸化的增加可以介導降壓藥maximakinin的降壓功能，且ERK1/2抑制劑U0126還抑制了Cx43的磷酸化[4]。因此，本課題組推測RMP可改善SHR的血壓，其中ERK1/2磷酸化和Cx43磷酸化介導ERK1/2-Cx43信號通路激活有關。因此，本文旨在觀察RMP對SHR大鼠血壓的作用并探討其調控機制。

1 材料與方法

1.1試劑與耗材:雷米普利(R0404-250 MG，溶解于生理鹽水)購于美國Sigma Aldrich公司。Cx43抑制劑甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)和ERK1/2抑制劑U0126均購于美Sigma Aldrich公司。蘇木精伊紅染色試劑盒及BCA蛋白濃度檢測試劑盒購于上海碧云天公司。聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜購于美國Millipore公司；脫脂奶粉購于美國BD公司。單克隆鼠抗GAPDH 抗體(TA-08)購于北京冷杉金橋生物科技有限公司；多克隆兔抗Cx43，ERK1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗體均購于美國Abcam公司，單克隆兔抗磷酸化Cx43抗體p-Cx43(Ser368)購于美國CST公司。二抗購于北京金橋生物科技有限公司稀釋劑；ECL化學發光試劑購于英國GE健保與生命科學公司。

1.2實驗動物:50只成年雄性SHR大鼠(10周齡，300～350g)和10只健康成年雄性wistar大鼠(10周齡，300～350g)購于新疆醫科大學實驗動物中心。實驗大鼠在白天/黑夜交替(12h/12h)的24℃室溫條件下飼養，并提供飲水和食物供自由攝取。本研究的所有動物實驗均經過我院動物倫理委員會審查通過。研究中所有動物實驗操作均按照美國國立衛生研究院(National Institutes Of Health,NIH)出版的《實驗室動物護理和使用指南》(出版物第85-23號，1996年)進行。

1.3動物給藥和分組:50只成年雄性SHR大鼠(300～350g)和10只健康成年雄性wistar大鼠(300～350g)購于新疆醫科大學實驗動物中心。實驗大鼠在白天/黑夜交替(12h/12h)的24℃室溫條件下飼養，并提供飲水和食物供自由攝取。SHR大鼠隨機數字表法分為SHR組、RMP+SHR組、RMP+甘珀酸[CBX，縫隙連接蛋白43(Cx43)抑制劑]+SHR組、RMP+CBX+U0126[細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)抑制劑)]+SHR組，n=10/組。健康wistar大鼠為control組(n=10)并與SHR組均給予生理鹽水40mL/kg i.v.，其余3組分別給予RMP 10mg/kg i.v.，RMP 10 mg/kg和CBX 13.5mg/kg i.v.，RMP 10 mg/kg和CBX 13.5mg/kg和U012612 mg/kg i.v.，尾靜脈推注。

1.4大鼠動脈收縮壓檢測:Control組、SHR組、RMP+SHR組、RMP+CBX+SHR組、RMP+CBX+U0126+SHR組的所有大鼠在給藥48h后，采用BP-6大鼠無創血壓測試儀讀取大鼠動脈收縮壓數值。

1.5大鼠腦組織分離:Control組、SHR組、RMP+SHR組、RMP+CBX+SHR組、RMP+U0126+SHR組、RMP+CBX+U0126+SHR組的大鼠接受戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射，麻醉后迅速處死動物。用鉤鑷固定大鼠顱骨，用組織剪分離顱骨和頸椎連接，剪開頭部皮膚，掀開顱骨暴露完整的腦組織，收集腦組織標本，將腦組織用冷生理鹽水清洗。分離顱底動脈，保存于4℃。

1.6大鼠顱底動脈(直徑<400μm)病理觀察:分離Control組、SHR組、RMP+SHR組、RMP+CBX+SHR組、RMP+U0126+SHR組、RMP+CBX+U0126+SHR組的的顱底動脈組織后。用含10%福爾馬林的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)固定顱底動脈。將固定基底動脈脫水，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，經二甲苯I(10 min)和二甲苯II(15 min)脫蠟，再經過乙醇[無水乙醇I(5 min)、無水乙醇II(5 min)、95%乙醇(2 min)、90%乙醇(2 min)、80%乙醇(2 min)、70%乙醇(2 min)]水化，用蒸餾水洗去乙醇。清洗后切片按試劑盒提供的說明書進行蘇木精伊紅(H&E)染色。乙醇脫水分化后，用BX50光學顯微鏡進行觀察。每個切片取自6個不同區域(200倍放大)，測量動脈血管厚度變化。

1.7Western blot:采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測Control組、SHR組、RMP+SHR組、RMP+CBX+SHR組、RMP+U0126+SHR組、RMP+CBX+U0126+SHR組的顱底動脈組織中蛋白的濃度。隨后均勻煮沸10min進行蛋白變性。將變性后的總蛋白用10%分離凝膠進行電泳，電泳完成后轉移至膜。將PVDF膜加入到含有50g/L脫脂奶粉的堵液中，將其置于室溫下的搖床上2h，然后在添加相應的一抗GAPDH(1∶1000)，Cx43(1∶1000)，p-Cx43(Ser368)(1∶5000)，ERK1/2(1∶1000)，p-ERK1/2(1∶1000)，第2天，PVDF膜在4℃搖床上孵育2h，然后加入相應的二抗(1∶5000)稀釋劑，用1×TBST洗滌3次(10min/次)。添加發光試劑到暗室中進行曝光，并在清洗后留下來進行顯影。使用Quantity One(Bio-Rad)評估每個目標蛋白條帶的光密度，GAPDH為內參蛋白。

2 結 果

2.1RMP的降血壓作用:SHR組大鼠呈高血壓癥狀，與Control組比，SHR組的收縮壓從118.25±12.33上調至178.63±12.64，差異具有統計學意義(均P<0.05)，與SHR組比，RMP+SHR組大鼠血壓降低了近30%(均P<0.05)。見圖1。

圖1 RMP對SHR大鼠的降壓作用

2.2RMP改善SHR大鼠腦動脈壁厚度變化:蘇木精-伊紅染色形態學分析了大鼠腦動脈壁的變化。與Control組比，SHR組大鼠腦動脈肥大，并表現為壁厚、管腔直徑、中膜厚度和管腔橫截面面積增加；與SHR組比，RMP+SHR組大鼠上述形態學變化明顯減輕。見圖2。

圖2 RMP改善SHR大鼠腦動脈壁厚度的影響

2.3RMP激活SHR大鼠體內ERK1/2-Cx43信號通路:觀察ERK1/2-Cx43信號通路蛋白的表達，SHR組p-ERK1/2和p-Cx43的水平都較Control組明顯降低，而ERK1/2和Cx43的表達差異不明顯(P<0.05)同樣與SHR組比，RMP+SHR組的ERK1/2和Cx43的表達差異不明顯(P<0.05)，但是p-ERK1/2和p-Cx43表達水平均上調，差異有統計學意義(P<0.05)。表明RMP可激活SHR大鼠體內ERK1/2-Cx43信號通路。見圖3。

圖3 Western blot檢測ERK1/2-Cx43信號通路信號蛋白的表達變化

2.4CBX聯合U0126抑制ERK1/2-Cx43信號通路的激活:與RMP+SHR組比，RMP+CBX+SHR組p-Cx43表達降低(均P<0.05)，p-ERK1/2的表達無明顯變化(P>0.05)，但RMP+U0126+SHR組p-Cx43和p-ERK1/2的表達都降低(均P<0.05)。另外，與RMP+CBX+SHR組或RMP+U0126+SHR組比，RMP+CBX+U0126+SHR組的p-Cx43和p-ERK1/2的表達都降低(均P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測ERK1/2-Cx43信號通路信號蛋白的表達變化

2.5阻斷ERK1/2-Cx43信號通路促進血壓升高和腦動脈壁增厚:與RMP+SHR組比，RMP+CBX+SHR組和RMP+U0126+SHR組的血壓明顯增高(圖5，均P<0.05)，大鼠腦動脈壁增厚嚴重，表現為壁厚、管腔直徑、中膜厚度和管腔橫截面面積增加，差異有統計學意義(圖6，均P<0.05)。與RMP+CBX+SHR組或RMP+U0126+SHR組比，RMP+CBX+U0126+SHR組的血壓增加(圖5，均P<0.05)，腦動脈壁厚增加(圖6，均P<0.05)。

圖5 阻斷ERK1/2-Cx43信號通路促進血壓升高

圖6 阻斷ERK1/2-Cx43信號通路增加大鼠腦動脈壁厚度。H&E染色圖(200X)。#，與SHR比，P<0.05。&，與RMP+SHR比，P<0.05。$，與RMP+CBX+SHR/RMP+U0126+SHR比，P<0.05。SHR：自發性高血壓大鼠；RMP：雷米普利。CBX：Cx43抑制劑；U0126：ERK1/2抑制劑。

3 討 論

本文研究果表明：①RMP存在下明顯減弱了SHR動脈血管壁厚度，從而緩解了血管腔狹窄。②RMP調控的這些病理變化與動物體內Cx43的以及ERK1/2的失活相關，而這些病理變化可被Cx43以及ERK1/2的抑制劑CBX和U0126逆轉。

在高血壓中，機械壓力和血流對血管壁的影響會破壞血管內皮，從而增加內皮的通透性。單核細胞、淋巴細胞和中膜平滑肌細胞進入內膜，正常血管結構消失，從而促使動脈血管重構的發生，嚴重引發栓塞[5,6]。血管緊張素Ⅱ作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統的重要組成部分，參與了高血壓的發生發展。下調血漿血管緊張素Ⅱ水平可延遲或逆轉血管重構，改善血管舒縮功能，改善血管順應性。在動脈重構過程中，血管同步收縮反應受到影響，從而改變血管舒縮功能[7]。RMP作為血管緊張素的抑制劑，不僅抑制血管緊張素I向血管緊張素Ⅱ的轉化，還與內源性緩激肽的積累有關，導致內皮依賴性血管舒張。例如，RMP可通過抑制血管緊張素轉化酶從而促進內皮B2激肽受體相關NO的釋放促進血管舒張，另外，RMP可以通過調控血緊張素轉化酶，并阻斷血管緊張素I向血管緊張素Ⅱ轉化的同時增加血管緊張素(1-7)，從而能減少緩激肽的降解，而血管緊張素(1-7)和緩激肽可協同促進血管舒張[7,8]。本研究觀察到RMP治療SHR后，血壓明顯降低，而動脈血管壁厚度同樣隨著RMP的治療而明顯減少。然而，這些變化背后的分子機制尚不清楚。

研究表明Cx43的水平與血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的表型密切相關，細胞因子誘導VSMC收縮表型的轉變與VSMC細胞中Cx43表達的增加有關[9]。VSMC的胞外信號的激活ERK1/2可以促進Cx43的磷酸化，而p-Cx43含量的增加則促進內皮細胞的電信號或化學信號傳遞并進一步調節血管張力，擴張血管，降低血壓，添加ERK1/2的抑制劑U0126能有效地阻斷p-Cx43的激活和相應的降壓效應[4]。另外，Cx43過表達能促進VSMC的增殖和遷移，而且Cx43表達減少(siRNA-Cx43)則可抑制血管緊張素Ⅱ誘導的細胞增殖和遷移[3]。一致的是，本研究結果首先觀察到高血壓動物模型中p-ERK1/2和p-Cx43表達均降低，而RMP治療后p-ERK1/2和p-Cx43的表達明顯增加，提示ERK1/2和Cx43被激活，而U0126和CBX都可以顯著下調p-Cx43的表達(CBX不影響p-ERK1/2的的表達)從而逆轉了RMP對高血壓和動脈血管壁增厚的抑制效果。本研究結果提示RMP通過上游ERK1/2磷酸化激活Cx43，激活Cx43進一步促進血管舒張，降低血壓。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是血管緊張素Ⅱ重要的下游靶點，MAPK通路是Cx43相關功能的關鍵調控通路，其中ERK1/2的磷酸化可以激活Cx43[10]。越來越多的研究報道ERK1/2信號與動脈血管的重塑和血管壁厚度密切相關[11]。本研究表明，ERK1/2信號可以被RMP激活，與此同時，利用組織學染色觀察到動脈壁厚度明顯減少，而ERK1/2的抑制劑U0126明顯增加了厚動脈壁的厚度，降低了Cx43 Ser368位點的磷酸化水平。表明RMP通過調控ERK1/2信號通路及下游的Cx43磷酸化從而調節大腦動脈高血壓和管壁厚度。GJs允許小代謝物和信號分子(如環磷酸腺苷和Ca2+)在連接的細胞之間進行穿梭，而不進入細胞外空間[11]。因此，當這些連接的細胞中的一些接收到信號時，整個細胞群都會做出反應。大腦動脈細胞之間的GJs連接通過影響細胞分化、遷移和存活在大腦發育中發揮作用[12]。研究表明，在高血壓期間，Cx43不僅在細胞間通訊中發揮重要作用，還能促進血管收縮，增加血管順應性，最終導致動脈重構[13,14]。不僅如此，本研究的結果發現在SHR中Cx43是一個受多級信號調控的蛋白分子，通過ERK信號轉導通路介導的Ser368位點磷酸化，表明Cx43在RMP改善的高血壓和動脈血管壁增厚中扮演重要角色。然而，仍需要更多的體外和體內高血壓模型來驗證ERK1/2-Cx43信號介導的SHR維持高血壓的機制，以及使用類似有RMP作用的藥物激活ERK1/2-Cx43通路的可能的抗高血壓作用。

總之，本研究結果表明，注射RMP降低SHR的血壓和動脈血管壁厚度，激活ERK1/2-Cx43通路。此外，用U0126抑制了ERK1/2-Cx43信號后明顯減弱了SHR的效果。表明RMP可能具有高血壓治療潛力，進一步研究靶向ERK1/2-Cx43信號的藥物對于減輕高血壓具有重要意義。