miR-21在心血管疾病中作用的研究進展

馬明仁，焦丕奇，王 菲，劉 燕，宋 佳，弓 宵，馬 凌 解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院 心血管內科，甘肅蘭州 730050； 西北民族大學 醫學部，甘肅蘭州 730000

全球每年因心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)死亡的人數約占疾病死亡總數的31.5%，約是癌癥死亡人數的2倍[1]。CVD已成為嚴重影響公共衛生的重要問題[2]。常見CVD主要包括急性心肌梗死 (acute myocardial infarction，AMI)、擴張性心肌病 (dilated cardiomyopathy，DCM)、心力衰竭 (heart failure，HF)、肺動脈高壓 (pulmonary arterial hypertension，PAH) 和心房顫動 (atrial fibrillation，AF)等[3]。近年來CVD的發病率雖然得到了一定控制，但仍需全面闡明發病機制以制訂更加簡捷、快速、有效的防控和診療措施。微RNA(miRNA/miR)是進化上保守的一類長度為18～25個核苷酸的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，其中miR-21是較早發現且被廣泛關注的miRNA之一[4]。大量研究佐證了miR-21與CVD密切相關，但其復雜調控網絡尚未闡明，極大地限制miR-21在臨床上推廣應用。鑒于此，本文聚焦miR-21與CVD的相關性，梳理匯總當前研究進展，以期為miR-21在CVD中的相關研究和臨床應用提供新思路。

1 miR-21概述

miR-21編碼基因定位于染色體17q23.2區域的空泡膜蛋白1基因座內[5]，具有5'-UAG CUUAUCAGACUGAU-3'保守序列，是長度為22個核苷酸的ncRNA。miR-21序列中鑒定出了保守增強子元件，包括激活蛋白1、Ets家族轉錄因子PU.1、CCAAT/增強子結合蛋白-α、核因子I、血清反應元件、p53、信號轉導與轉錄激活因子3。miR-21是機體表達最豐富的miRNA，在大多數細胞中存在， 在CVD、腫瘤和炎癥誘導疾病中均能觀察到miR-21表達變化，也有研究證實miR-21參與調節各種免疫、發育和中樞神經系統疾病進展[6]。細胞特異性研究表明miR-21在巨噬細胞、單核細胞和樹突狀細胞中表達水平最高[7]，miR-21在所有心血管細胞中均有分布，在心肌成纖維細胞(cardiac fibroblast，CF)中的表達水平明顯高于心肌細胞[8]。miR-21的分布特性使其容易在血漿、血清等體液中被鑒定，因此也成為CVD特異性診療靶點最佳研究對象。

2 miR-21與心肌細胞凋亡

心肌細胞為了更好地適應環境會啟動自身程序性細胞凋亡，這種凋亡受到機體的嚴密監控，miRNA在其中扮演重要的“監控”職責。miR-21作為心肌細胞豐富表達的miRNA，在抑制心肌細胞凋亡中發揮關鍵調控作用。早期動物實驗表明大鼠心肌梗死 (myocardial infarction，MI)區域與梗死邊緣區域miR-21差異表達，上調miR-21表達后MI面積減少29%，表明miR-21對心肌細胞具有抗凋亡和修復作用[9]。Song等[10]同樣驗證了miR-21在MI中抑制心肌細胞凋亡、改善心臟功能的關鍵調控作用。心肌細胞對缺氧極為敏感，miRNA測序研究缺氧應激對大鼠心肌細胞(H9C2)及其相應外泌體的影響發現，低氧誘導的外泌體miRNA (包括 miR-21-5p、miR-378-3p、miR-152-3p和let-7i-5p)具有潛在抗心肌細胞凋亡作用[11]。Gu等[12]研究證實血清來源的細胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)顯著減少AMI細胞模型和AMI小鼠模型的心肌細胞凋亡，并減輕AMI小鼠心臟梗死面積，AMI后小鼠心臟中miR-21表達與血清EV呈負相關，miR-21可降低血清EV抑制心肌細胞凋亡的作用，血清EV通過調節miR-21/PDCD4信號通路保護AMI。Hinkel等[13]在豬的MI和HF模型中發現miR-21在左心室心肌的遠端和邊緣區逐漸上調，這與miR-21發揮抗心肌細胞凋亡作用密切相關。Zhang等[14]探討了miR-21介導的成纖維細胞生長因子 1(fibroblast growth factor 1，FGF1)對冠狀動脈粥樣硬化性心肌病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)大鼠心肌缺血的保護作用，發現miR-21可特異性介導FGF1表達，從而減輕心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷，發揮抗心肌細胞凋亡和保護心臟的功能。大量研究已證實紅景天苷對心肌損傷、心肌缺氧和I/R損傷具有保護作用，Liu等[15]研究數據表明紅景天苷預處理逆轉了缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)誘導的miR-21下調，減弱心肌細胞毒性和凋亡，抑制了心肌I/R損傷，miR-21有助于紅景天苷對H9C2細胞中H/R誘導的氧化應激的保護作用。Huang等[16]也驗證了在H/R損傷期間H9C2細胞中miR-21表達下調自噬顯著增加，miR-21及其前體的過表達可通過激活AKT/mTOR通路，抑制自噬活性并減少細胞凋亡。研究發現miR-21在缺血后處理(ischemic postconditioning，IPost)小鼠心臟中顯著上調，IPost可以減少I/R損傷引起的左心室梗死面積，改善心臟功能，抑制心肌細胞凋亡，敲低miR-21可以逆轉IPost對小鼠I/R損傷的保護，miR-21通過PTEN/Akt信號通路在心肌細胞凋亡中發揮保護作用[17]。轉染miR-21模擬短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)的人心肌細胞凋亡率明顯下降，這與下調p-JNK、p-p38 MARK和Caspase-3的蛋白表達有關，表明miR-21通過激活JNK/p-38 MARK/Caspase-3信號通路抑制腫瘤壞死因子-α誘導的凋亡[18]。

3 miR-21與CVD相關脂類代謝

脂質代謝紊亂是CVD的重要風險因素之一，已證實miRNA能夠在多個器官中調節脂類代謝，改變機體低密度脂蛋白 (low density lipoprotein，LDL)和 高 密度 脂蛋白 (high density lipoprotein，HDL)的含量從而參與CVD進程，是脂質穩態的重要調節因子。心血管相關病變是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD) 患者死亡的主要原因，Surina等[19]描述了5/6腎切除大鼠CKD模型的左心室病理學特征，發現miR-21-5p在左心室表達上調，并證實miR-21-5p通過靶向PPARα改變許多與脂肪酸氧化和糖酵解相關的轉錄物的表達，在H9C2細胞中進一步研究發現miR-21-5p的過表達減弱了H9C2細胞中的脂質含量和脂質過氧化，對糖酵解和脂肪酸氧化途徑的依賴可通過細胞內miR-21-5p的豐度來調節。長鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA，LncRNA)GAS5 及其靶miR-21調節血脂、巨噬細胞、Th細胞、血管平滑肌細胞，參與動脈粥樣硬化(atherosclerosis ，AS)及相關CHD發生發展，Jiang和Du[20]進一步探討其循環表達與CHD患者常見生化指標、狹窄嚴重程度、細胞因子的相關性，發現Lnc-GAS5與CHD患者的miR-21水平呈負相關，循環中的Lnc-GAS5及其靶miR-21有望作為治療CHD潛在靶點。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導的血管內皮損傷、氧化應激和炎癥反應在AS的病理生理中起著至關重要的作用。miR-21可介導CASC7許多病理生理機制，Pei等[21]采用ox-LDL刺激HUVEC和VSMC來建立AS體外模型檢測CASC7水平，分析CASC7/miR-21軸中 TLR4/NF-κB 和 PI3K/AKT 通路的潛在功能，結果表明LncRNA-CASC7通過抑制miR-21表達，調節TLR4/NF-κB和PI3K/AKT信號通路，影響ox-LDL誘導的AS細胞模型病理進展。Feng等[22]也證實不同劑量和次數的脂多糖刺激巨噬細胞后，miR-21通過TLR4-NF-κB途徑負調節脂多糖誘導的巨噬細胞脂質積累和炎癥反應，表明過表達miR-21可作為預防和治療AS疾病新方案。諸多研究證據表明miR-21與脂類代謝密切相關，而脂類代謝異常又是CVD重要危險因素，尤其是在CHD病理進程中。因此，闡明miR-21與CVD相關脂類代謝機制或許會為CVD診療提供更多可行方案。

4 miR-21與心肌纖維化

心肌纖維化是心臟重塑中的重要事件，包括成纖維細胞激活和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度產生[23]，CF向肌成纖維細胞轉化是纖維化的關鍵機制。ECM由多種結構蛋白、基質細胞分子、蛋白聚糖、乙酰透明質酸以及各種糖蛋白組成，它們相互協作和連接以產生生物活性聚合物。研究表明ncRNA(miR-19、miR-21、miR-26、miR-29、miR-30、miR-133、miR-140等)在與 ECM破壞或分解相關的疾病(如心/肺纖維化、心肌病、骨關節病和癌癥等)中表達失調，ncRNA在調節ECM構象、改變位于該環境中細胞表型方面發揮重要調控作用[24]。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導 miR-21 表達，TGF-β信號轉導的SMAD效應子與DROSHA相互作用以促進初級miR-21加工成前體miR-21(pre-miR-21)，TGF-β/Smad2/3依賴或非依賴性通路是心肌纖維化發病機制中的主要信號分子核心[25]。Yuan等[26]發現miR-21在體內MI后梗死區表達上調，生物信息學、蛋白質印跡分析和熒光素酶報告基因檢測表明Smad7是miR-21直接靶標，miR-21過表達促進了TGF-β1誘導的CF激活，miR-21通過 TGF-β/ Smad7 信號通路在 MI后 CF 激活和心臟纖維化過程中起關鍵作用。另一項研究也表明miR-21通過靶向Jagged1和SMAD7介導TGF-β引起的成纖維細胞活化。心臟巨噬細胞(cardiac macrophage，cMP)是心肌穩態和疾病的重要調節因子，RNA測序顯示miR-21是cMP中表達最高的miRNA。Ramanujam等[27]探討巨噬細胞miR-21在心肌穩態和疾病相關重塑中的功能，發現cMP在壓力超負荷的心臟纖維化和功能障礙中起重要作用，并揭示巨噬細胞miR-21是cMP促纖維化作用的關鍵分子。心臟纖維化是糖尿病性心肌病的主要特征之一，表現為心臟細胞外基質蛋白的過度積累。miR-21、miR-150-5p、miR-155、miR-451等在糖尿病患者心臟中上調，并通過靶向CF、內皮細胞和心肌細胞中的信號通路促進心臟纖維化[28]。心肌纖維化是CVD發生發展的主要病理表現，miR-21在其中發揮的重要調控作用毋庸置疑，其表達水平與組織纖維化程度密切相關，雖然miR-21在細胞研究模型中被證實具有促纖維化作用，但能否將其作為診療心肌纖維化相關疾病的特異性靶點有待更多研究佐證。

5 結語

本文以心肌細胞凋亡、脂類代謝異常、心肌纖維化為切入點總結了miR-21與CVD的最新研究進展。miR-21在CVD中發揮的關鍵調控作用已有大量研究報道(表1)，通過文獻總結發現當前對于miR-21在CVD中的相關研究大多停留在生物信息預測、細胞和動物模型驗證水平，尚未全面系統反映miR-21在機體內發揮的整體調控作用，限制了其在臨床上的推廣應用。心肌細胞內部凋亡信號通路的復雜性使得miR-21在調控心肌細胞凋亡方面存在差異性。已有實驗數據證實miR-21在心肌細胞中起到抗凋亡作用，而在另外一些細胞類型中發揮促凋亡作用，對此現象合理的解釋是miR-21具有多個靶基因，靶基因也同時受到多個miRNA調控，miR-21在心肌細胞凋亡中只是一個節點，其復雜的調控機制尚未闡明。miR-21是協同指數最高的miRNA，其在高協同miRNA對中頻繁出現，如miR-21與miR-1協同在抗心肌細胞凋亡方面作用顯著，miR-21與miR-146協同調節p38-Caspase3信號通路發揮抗心肌細胞凋亡作用[40]。miR-21在脂類代謝異常中發揮的關鍵調控作用已被證實，也有研究報道miR-21抑制冠心病炎癥過程的同時參與冠狀動脈斑塊形成，導致斑塊不穩定性增加，miR-21參與CVD調控具有復雜性和兩面性。miR-21無疑是心肌纖維化領域的明星分子，但當前研究主要集中于miR-21對心肌纖維化病理性進程調控，而忽略了miR-21如何調節CF的生理功能，今后有待深入研究以更加系統地闡明miR-21調控心肌纖維化機制。

表1 miR-21在CVD中的靶點、表達、作用和信號通路Tab.1 The target, expression, role and signaling pathway of miR-21 in CVD

miR-21在CVD事件發生、發展中的關鍵調控作用已有大量研究證據佐證，但應用在臨床還存在諸多問題，例如miR-21是組織高表達的miRNAs，其作為CVD生物標志物的特異性如何？實現臨床轉化用于治療CVD，miR-21在體內安全性如何評價，是否會產生毒性不良反應仍然未知。此外，miR-21在CVD相關疾病中往往會呈現動態變化表達，不同病理時期其表達會發生相應變化，對于此變化臨床應用后該如何監測[41]？這些問題有待于深入開展臨床研究以逐步解決。