穿膜肽鈷原卟啉藥物復(fù)合體對人晶狀體上皮細胞的保護作用實驗

劉雅婷，馬天駒，葉 子，李朝輝

解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心 眼科醫(yī)學(xué)部，北京 100853

在世界范圍內(nèi)，年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)是患病率最高的致盲性眼病，全球50歲以上的人群中有9%的患者因為白內(nèi)障而喪失視力[1]。因此研究能夠抑制白內(nèi)障形成并減緩其發(fā)展的藥物具有重要的臨床價值。ARC的發(fā)病機制目前尚不明確，但氧化應(yīng)激介導(dǎo)的晶狀體上皮細胞 (human lens epithelial cells，LECs)凋亡與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是體內(nèi)分布最廣泛的抗氧化酶之一，已有研究證明其在細胞的氧化應(yīng)激損傷過程中有重要的保護作用[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HO-1激活劑鈷原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)可以通過下調(diào)活性氧，上調(diào)還原性谷胱甘肽和超氧化物歧化酶等抗氧化應(yīng)激酶的含量，抑制H2O2誘導(dǎo)的人LECs凋亡[5]。但一些大分子藥物很難通過局部滴眼液或口服藥物在眼內(nèi)達到適宜治療濃度[6]。細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一類不需要依賴受體，可以直接穿過細胞膜的多肽[7]。這類多肽可以攜帶生物活性物質(zhì)進入細胞和組織，其低毒性和多組織普適性使之成為優(yōu)良的藥物載體[8]。有文獻報道使用穿膜肽聯(lián)合雷珠單抗局部滴眼給藥作為玻璃體注藥的替代療法治療脈絡(luò)膜新生血管[9]。因此我們選用CoPP作為本研究中穿膜肽攜帶的藥物。利用人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04)檢測穿膜肽藥物復(fù)合體R6-CoPP細胞膜穿透效果和對細胞活性的影響，并比較R6-CoPP與單純CoPP對LECs氧化損傷的保護作用。期望能夠為ARC的藥物治療研究提供新的方法和思路。

材料與方法

1 主要試劑和設(shè)備 鈷原卟啉 (CoPP，CAS：102601-60-5，美國Sigma公司)、Fmoc-氨基酸、2-氯三苯甲基氯樹脂 (2-chlorotrityl chloride resin，CAS：934816-82-7)、2-(1H-苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基硫脲六氟磷酸鹽(HBTU)、二氯甲烷、二異丙基乙胺(DIEA)、哌啶、二甲基甲酰胺(DMF)、異硫氰酸熒光素(5-Fitc)、三氟乙酸(TFA)、三異丙基硅烷、1,2-乙二硫醇(上海強耀生物科技有限公司)；半自動多肽合成儀(上海岐昱實業(yè))；高效液相色譜儀(HPLC，美國安捷倫公司)；質(zhì)譜分析儀(MS，日本島津公司)；納米粒度及Zeta電位分析儀(美國Malvern公司)；凍干機(德國Christ公司)；共聚焦熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(德國Laica公司)；流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)；酶標儀ELX800(美國BioTeK公司)；DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)高糖培養(yǎng)基、胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本株式會社同仁化學(xué)研究所)；含DNA結(jié)合染料Dapi甘油封片劑(北京索萊寶科技有限公司)等。其余試劑均為分析純。

2 R6-CoPP 的制備和表征檢驗 參考 Cogan 等[9]的實驗方法選擇陽離子穿膜肽中穿膜能力較強的寡聚精氨酸R6(RRRRRR)，添加賴氨酸(K)穩(wěn)定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，利用脫水縮合的原理將其與CoPP連接，最后添加FITC熒光標記，序列為CoPP-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys(5-FITC)。使用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)moc)固相合成法合成R6-CoPP，產(chǎn)物的合成及純化由上海強耀生物科技有限公司協(xié)助。簡述步驟如下：將樹脂溶脹后加入Fmoc-Lys(Dde)-OH作為首位氨基酸，甲醇溶液封尾，20%哌啶DMF溶液脫保護后使用HBTU和DIEA作為縮合劑，DMF作為活化劑，按照從Lys到Arg的順序依次連接序列中的氨基酸，直至最后連接CoPP，使CoPP的羧基隨機與Arg殘基中的氨基進行縮合反應(yīng)，去掉Lys側(cè)鏈保護后加入5-FITC連接。切割液切割后用乙醚析出干燥后得到粗產(chǎn)物，利用反相色譜制備系統(tǒng)提純。最后使用HPLC分析儀和質(zhì)譜儀(MS)檢測并計算純化后產(chǎn)物的純度和相對分子質(zhì)量。高效液相色譜參數(shù)：Kromasil 100-5C18，30℃，流動相A為0.1% TFA + 乙腈，流動相B為0.1%TFA + 純水，梯度流速 1.0 mL/min，檢測波長220 nm。質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧 (ESI)，電壓 4.5 kV±，霧化器(NEB)12.0，簾氣(CUR)6.0。凍干產(chǎn)物加入去離子純水制備成澄清溶液，稀釋后用激光納米粒度測量儀和Zeta表面電位測量儀對產(chǎn)物進行檢測。滴加R6-CoPP溶液于銅網(wǎng)支持膜上，干燥后采用透射電鏡進行成像。利用掃描透射高角環(huán)形暗場 (high angle annular dark field，STEM-HAADF)成像技術(shù)進行EDS面掃和線掃[10]。觀測穿膜肽復(fù)合物的粒子形貌和鈷元素分布表征。

3 細胞培養(yǎng) SRA01/04 人晶狀體上皮細胞系

(LECs)購于廣州賽庫生物技術(shù)有限公司。LECs細胞培養(yǎng)使用含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱設(shè)置為37℃、5% CO2。細胞復(fù)蘇后每日鏡下觀察細胞形態(tài)，融合達到80%左右時按1∶3進行傳代。傳代3 ~ 5次后，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

4 R6-CoPP 的細胞毒性檢測 以 3 × 103/孔的細胞密度將LECs接種于96孔板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁舒展。將細胞分為對照組和R6-CoPP處理組，對照組不加入藥物正常培養(yǎng)，R6-CoPP 組分別加入濃度為 20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL 的 R6-CoPP，每組 3 個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后PBS清洗細胞3次，將CCK-8與培養(yǎng)基按1∶10的比例混合為CCK-8工作液，每孔加入110 μL的工作液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標儀測量各孔在450 nm波長處的吸光度值。根據(jù)各組的吸光度值，以對照組為參照計算細胞存活率。細胞存活率在75% ~ 100%區(qū)間內(nèi)說明材料的細胞毒性低，生物相容性良好。

5 細胞流式儀檢測 R6-CoPP 的穿膜能力 以 3 ×104/孔的細胞密度將LECs接種于6孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后分別更換濃度為 10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL 的 FITC 標記的 R6-CoPP 孵育 2 h，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，0.25%胰蛋白酶消化、收集細胞，流式細胞儀上機分析熒光陽性細胞比例。

6 共聚焦顯微鏡觀察 R6-CoPP 在細胞內(nèi)的定位以 5 × 103/孔的細胞密度將 LECs 接種于 35 mm共聚焦培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，鏡下檢查細胞貼壁舒展后，更換R6-CoPP濃度為20 μg/mL的培養(yǎng)基孵育 0.25 h、3 h、6 h、24 h，以未加藥培養(yǎng)的細胞作為對照組，PBS洗滌3次后每皿加入1 mL的4%多聚甲醛常溫下固定細胞20 min。固定完成后PBS洗滌3次，每皿加入1 ~ 2滴含DNA結(jié)合染料DAPI的甘油封片劑，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

7 R6-CoPP 體外抗氧化應(yīng)激損傷效果評價 以3 × 103/孔的細胞密度將LECs接種于96孔板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，實驗組分別加入H2O2濃度為200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，對照組僅換液，每組3個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后用CCK-8試劑盒檢測各組細胞的存活率，選擇存活率＜50%的濃度用于后續(xù)的實驗。藥物預(yù)處理細胞24 h后更換含有H2O2的培養(yǎng)基孵育24 h構(gòu)建細胞氧化損傷模型[5,11]。細胞處理同前。將細胞隨機分組：對照組，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；H2O2氧化損傷模型組，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后更換 H2O2濃度 600 μmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h；CoPP預(yù)處理組，CoPP濃度為10 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h 后更換 H2O2濃度 600 μmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；R6-CoPP預(yù)處理組，R6-CoPP濃度為20 μg/mL 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h后更換H2O2濃度600 μmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)結(jié)束后用CCK-8法檢測各組吸光度并計算各組的細胞存活率。

8 統(tǒng)計學(xué)分析 使用 GraphPad Prism 8.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高效液相色譜和質(zhì)譜鑒定 R6-CoPP 根據(jù)HPLC色譜圖計算得出合成的R6-CoPP主峰明顯，純度為94.56%，雜質(zhì)較少，純度較高。質(zhì)譜分析結(jié)果計算后得出相對分子質(zhì)量為2109.75，與預(yù)計分子量2109.82十分接近，見圖1。納米粒徑和表面電位測量儀檢測結(jié)果見圖2，粒徑227.8 nm，表面電位 + 13.9 mV。表面攜帶陽性電荷。透射電鏡圖像中可觀察到結(jié)構(gòu)疏松的R6-CoPP多肽顆粒(圖3A)，X線能譜元素分布(EDS-Mapping)圖像中可見代表鈷元素的亮點分布在R6-CoPP中(圖3B)，雙峰X線斷層掃描圖可見鈷元素曲線(圖3C)。

圖1 R6-CoPP高效液相色譜分析圖和質(zhì)譜分析圖Fig.1 High-performance liquid chromatography and mass spectrometry of the cell-penetrating peptide drug complex (R6-CoPP)

圖2 R6-CoPP的粒徑和Zeta電位分布圖Fig.2 Size distribution and Zeta potential distribution of R6-CoPP

2 R6-CoPP 對 LECs細胞活性的影響 使用不同濃度R6-CoPP處理LECs細胞，24 h后對照組以及 R6-CoPP濃度為 20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL 的細胞存活率分別為 100.01% ± 3.86%、97.99% ± 2.55%、91.02% ± 12.32%、86.47% ± 9.14%、62.09% ± 2.60%(F=13.17，P＜0.05)。小于 80 μg/mL濃度的處理組相比對照組細胞存活率雖然有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。濃度為100 μg/mL處理組細胞存活率小于75%(P＜0.05)。見圖4。

3 的細胞膜穿透能力 流式結(jié)果顯示，濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL 的 R6-CoPP 與細胞共培育2 h后均檢測出了較強FITC熒光信號，熒光信號分別為82.33%±6.25%、89.53%±3.84%、95.80%±1.21%(F=399.4，P＜0.000 1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。熒光陽性細胞比例隨著濃度的升高遞增，不同濃度的R6-CoPP處理組與對照組的熒光陽性細胞比例均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。R6-CoPP濃度為40 μg/mL處理組的熒光陽性細胞比例大于濃度為 20 μg/mL 和 10 μg/mL 的 R6-CoPP處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。熒光顯微鏡觀察顯示，孵育15 min后R6-CoPP已經(jīng)大量進入細胞，熒光強度較高(圖6)。圖7中細胞3D圖像中可見綠色熒光分布于整個細胞質(zhì)，并不局限于細胞膜周圍。細胞內(nèi)的熒光強度隨著孵育時間的增加而下降，24 h后幾乎不可見。

圖5 不同濃度R6-CoPP孵育2 h后熒光信號陽性細胞比例(aP＜0.05，vs 對照組；bP＜0.05，vs 10 μg/mL 組，cP＜0.05，vs 20 μg/mL 組；n=3)Fig.5 Fluorescence positive cell ratio in cells cultured with different concentrations of R6-CoPP for 2 h (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs 10 μg/mL group; cP＜0.05, vs 20 μg/mL group; n=3)

圖6 R6-CoPP(20 μg/mL)與晶狀體上皮細胞孵育不同時間后細胞內(nèi)的熒光分布(40×，比例尺50 μm)Fig.6 Observation of green FITC fluorescence in LECs after cultured with R6-CoPP at different time points under a Confocal Fluorescence microscope (40×, scale bar=50 μm)

圖7 共聚焦顯微鏡構(gòu)建3D圖像觀察R6-CoPP(20 μg/mL)與細胞孵育不同時間后細胞內(nèi)的熒光分布(40×)Fig.7 Observation of green FITC fluorescence in LECs after being cultured with R6-CoPP(20 μg/mL) at different time points in a 3D picture created by a Confocal Fluorescence microscope (40×)

4 R6-CoPP 體外抗氧化應(yīng)激損傷效果 CCK-8 法檢測顯示，隨著H2O2濃度的增加，細胞存活率均下降。H2O2濃度為0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L 和600 μmol/L 的細胞存活率分別為100.21% ± 14.30%、73.99% ± 2.12%、47.69% ± 4.10%、42.98% ± 10.69%(F=24.58，P＜0.0002)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。當(dāng)H2O2濃度＞400 μmol/L時細胞存活率＜50%，后續(xù)實驗選擇600 μmol/L的H2O2進行氧化損傷模型組造模(圖8)。對照組、H2O2氧化損傷模型組、CoPP預(yù)處理組、R6-CoPP預(yù)處理組的細胞存活率分別為100.61% ± 1.34%、35.64% ± 2.25%、50.56% ± 1.37%、58.95% ± 1.25%(F=902.9，P＜0.0001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。與H2O2氧化損傷模型組相比，R6-CoPP預(yù)處理組、CoPP預(yù)處理組的細胞存活率顯著提高(P＜0.05)。與CoPP預(yù)處理組相比，R6-CoPP預(yù)處理組的細胞存活率更高(P＜0.05)。見圖9。

圖8 不同濃度的H2O2對LECs細胞活性的影響(aP＜0.05，vs 對照組；n=3)Fig.8 Effect of different concentrations of H2O2 on cell viability(aP＜0.05, vs control group; n=3)

圖9 CoPP和R6-CoPP預(yù)處理對于H2O2誘導(dǎo)后細胞存活率的影響 (aP＜0.05，vs 對照組；bP＜0.05，vs 模型組；cP＜0.05，vs CoPP預(yù)處理組；n=3)Fig.9 Effect of CoPP and R6-CoPP pretreatment on cell viability of LECs treated with H2O2 (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs H2O2 group; cP＜0.05, vs H2O2 + CoPP group; n=3)

討 論

目前關(guān)于載藥系統(tǒng)的研究多集中在脂質(zhì)體和聚殼糖等高分子材料包載藥物，通過延長滴眼液藥物在角膜表面的停留時間來增強藥物的穿透效果[12]，而穿膜肽作為載體利用其穿透特性構(gòu)建眼部給藥系統(tǒng)的研究較少。有許多研究表明穿膜肽的細胞毒性較低，其中陽離子富精氨酸穿膜肽還具有一定的神經(jīng)保護作用[13]。穿膜肽可以通過共價結(jié)合或單純結(jié)合的方式攜帶藥物，提高藥物進入細胞的能力。Zou等[14]報道利用穿膜肽攜帶藥物通過血腦屏障治療中樞神經(jīng)疾病。在眼科領(lǐng)域，Gonzalez-Pizarro等[15]利用TAT修飾高分子聚合物納米粒子(PEG-PLAG)攜帶氟米龍進入眼

內(nèi)，在眼前節(jié)和眼后段發(fā)揮抗炎效果。

本實驗中我們選擇寡聚精氨酸R6作為藥物載體，通過脫水縮合的方式將其與CoPP共價結(jié)合。經(jīng)過質(zhì)譜檢測計算合成產(chǎn)物分子質(zhì)量為2109.75，與預(yù)計分子量2109.82接近。而透射電鏡和元素曲線分析進一步驗證了鈷元素與穿膜肽藥物的同步

分布，表明藥物與穿膜肽成功連接。運送載體表面的正電荷可以與攜帶負電荷的細胞膜相互吸引并結(jié)合，通過細胞內(nèi)吞或融膜作用增加載體轉(zhuǎn)入細胞的效率[7]。寡聚精氨酸是陽離子型穿膜肽，在生理的pH值環(huán)境中攜帶正電荷，R6-CoPP表面攜帶正電荷13.9 mV，略高于Gao等[16]研究中富精氨酸穿膜肽修飾的脂質(zhì)體類藥物的表面電位，考慮因為大部分脂質(zhì)體類藥物攜帶有較強的負電荷。雖然通過穿膜肽修飾可以降低或逆轉(zhuǎn)脂質(zhì)體類藥物載體所帶負電荷以提高藥物的吸收率[16-17]，但載藥脂質(zhì)體的制作工藝更為復(fù)雜，且許多研究都是通過室溫孵育，利用分子間的電荷吸引作用將大分子蛋白或載藥脂質(zhì)體與穿膜肽連接[9,18]，在連接的時候也會產(chǎn)生裝載藥物泄露的問題。本實驗通過脫水縮合的方式在固相合成的過程中將CoPP上的羧基與穿膜肽游離的氨基連接，形成的酰胺鍵較為穩(wěn)定，且可以通過檢測合成產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量確保藥物與穿膜肽連接。經(jīng)細胞體外實驗檢測R6-CoPP在80 μg/mL濃度下對細胞活性無明顯影響，且與Liu等[19]的聚精氨酸類穿膜肽修飾藥物的生物安全濃度相近，生物相容性較好。流式細胞檢測結(jié)果顯示，在相同的孵育時間，R6-CoPP濃度越高，熒光陽性細胞比例越高，即攝入R6-CoPP的細胞越多，但Zuconelli等[20]的研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的聚精氨酸類陽離子穿膜肽直接穿過細胞膜進入細胞時可能會導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子含量的增加，而晶體內(nèi)部由于代謝失衡導(dǎo)致的鈣離子濃度升高也在白內(nèi)障的形成中具有一定作用。因此我們選擇較低濃度的20 μg/mL作為實驗濃度。根據(jù)共聚焦熒光顯微鏡顯示R6-CoPP可以被晶狀體上皮細胞攝取，且均勻分布于細胞質(zhì)，具有高效的細胞膜穿透能力。在利用H2O2模擬的LECs氧化損傷模型中，R6-CoPP表現(xiàn)出了與CoPP相近的減輕上皮細胞凋亡的作用。由于實驗的局限性，只在細胞水平檢測了藥物的抗氧化損傷作用，并不能確定R6-CoPP是否能在體內(nèi)實驗中發(fā)揮出抗白內(nèi)障、減緩白內(nèi)障疾病進展的作用。需要進一步進行體內(nèi)實驗驗證。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一種穿膜肽藥物復(fù)合體，細胞相容性較好，具有較強的細胞膜穿透能力，在體外實驗中表現(xiàn)出了一定的抗氧化損傷作用，給未來的白內(nèi)障預(yù)防和延緩其進展的藥物研究提供一定的啟發(fā)。