基于特征圖譜和一測多評法的黃柏質量控制研究

袁漢文，呂夢穎，羅江溢，邱伊星，劉 楊, 2，彭彩云*，王 煒*

基于特征圖譜和一測多評法的黃柏質量控制研究

袁漢文1，呂夢穎1，羅江溢1，邱伊星1，劉 楊1, 2，彭彩云1*，王 煒1*

1. 湖南中醫藥大學藥學院 中醫藥民族醫藥國際聯合實驗室，中巴中醫藥民族醫藥研究國際合作基地，創新藥物研究所，湖南 長沙 410208 2. 湖南省食品藥品檢驗研究院，湖南 長沙 410001

建立能有效區分黃柏與其易混淆品種關黃柏的特征圖譜及一測多評方法，促進黃柏臨床用藥的安全性與有效性。利用HPLC對黃柏中化學成分進行分析，對色譜條件進行優化，確定最佳色譜條件，建立特征圖譜，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）對特征圖譜數據進行分析，篩選和確認差異性化合物，以鹽酸小檗堿為參照物，建立一測多評方法測定黃柏主要有效成分含量。所建立的特征圖譜及一測多評方法能鑒別黃柏與關黃柏，以木蘭花堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿以及一未知化合物（7號峰）為差異性化合物，黃柏中鹽酸小檗堿含量明顯高于關黃柏，黃柏中鹽酸巴馬汀峰面積極低而關黃柏中其峰面積較高。黃柏中木蘭花堿的含量較低而未知化合物（7號峰）峰面積較高。所建立的特征圖譜和一測多評方法簡便，可作為《中國藥典》修改標準的參考，用于黃柏的質量控制。

黃柏；關黃柏；特征圖譜；一測多評；質量控制；木蘭花堿；鹽酸巴馬汀；鹽酸小檗堿

黃柏為蕓香科黃柏屬植物黃皮樹Schneid.的干燥樹皮，其廣泛分布于中國西南地區，又習稱“川黃柏”[1-2]。關黃柏為蕓香科植物黃檗Rupr.的干燥樹皮[1]。兩者均為常用中藥，其具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡等作用，常用于濕熱瀉痢、黃疸尿赤、帶下陰癢、熱淋澀痛、腳氣痿壁、骨蒸勞熱等癥[3]。《中國藥典》2000年版及之前各版本《中國藥典》中“川黃柏”和“關黃柏”均收載于黃柏項下[4]，而自從《中國藥典》2005年版開始，“川黃柏”和“關黃柏”被分列為2種藥材[5]。

盡管被《中國藥典》分列開來，黃柏與關黃柏的性味與歸經及功能與主治相同。兩者中的主要化學成分均為生物堿，如小檗堿、木蘭花堿、藥根堿等[6-9]。此外，其具有相似的生物活性或藥理作用如抗菌、利尿、調血壓、降血糖、抗氧化等[10]。因此臨床應用上并未特別強調二者的差別，藥材市場及成方制劑中也存在混用現象[11]。由于地理和歷史的原因，中藥藥材品種混亂，基原復雜，加之中藥的同名異物或同物異名現象普遍存在，甄別藥材優劣、鑒別真偽變得異常困難[12]。然而，《中國藥典》目前還沒有強調對同源近屬品種進行區分。而國際主流藥典，如《美國藥典》和《歐洲藥典》均注重利用薄層色譜、指紋圖譜或特征圖譜等分析手段，從化學成分的角度鑒別同源近屬品種，從而達到甄別真偽優劣的目的[13]。

為推動黃柏現代化及國際化進程，建立有效的、能被國際社會認可的質量控制標準，促進黃柏臨床用藥的安全性和有效性，本研究利用高效液相色譜（HPLC）建立了黃柏的特征圖譜，并在特征圖譜的基礎上建立了一測多評的方法，用于測定黃柏中黃柏堿、木蘭花堿和小檗堿的含量，闡明黃柏和關黃柏主要化學成分差異性。此外，為進一步驗證和篩選差異性化合物，本研究結合化學計量學方法如主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）對黃柏和關黃柏的特征圖譜數據進行了比較分析。本研究系統闡明了易混淆品種黃柏和關黃柏的化學成分的差異性，所建立的特征圖譜和一測多評含量測定方法能準確區分兩者，可作為中國藥典修改標準的參考，用于黃柏的質量控制。

1 材料與儀器

1.1 材料

27批黃柏藥材采集于四川（HB-1～HB-15）、湖南（HB-16～HB-22）、廣西（HB-23～HB-27），經湖南中醫藥大學龔力民副教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹Schneid.的干燥樹皮；6批關黃柏藥材分別采集于吉林（GHB-1～GHB-2）、遼寧（GHB-3～GHB-4）和黑龍江（GHB-5～GHB-6），經湖南中醫藥大學龔力民副教授鑒定為蕓香科植物黃檗Rupr.的干燥樹皮；對照品鹽酸小檗堿（批號ST03070120）、鹽酸巴馬汀（批號ST03040120）、鹽酸黃柏堿（批號ST08670120）、鹽酸藥根堿（批號ST03080120）、木蘭花堿（批號ST15050120）均購于上海詩丹德標準技術服務有限公司，所有對照品質量分數均大于98%；色譜級甲醇和乙腈購于美國Sigma-Aldrich公司；水為純凈水（華潤怡寶飲料有限公司）。

1.2 儀器

Mettler-Toledo AE100S型電子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ2200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，配備二極管陣列檢測器）；Waters e2695高效液相色譜儀（沃特世公司，配備2489 UV/Vis檢測器）；Waters Atlantis? T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司）；Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，安捷倫科技有限公司）；Agilent Poroshell EC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 μm，安捷倫科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

黃柏和關黃柏藥材粉碎后過四號篩，取樣品粉末0.25 g，精密稱定，置于25 mL錐形瓶中，加10 mL鹽酸甲醇溶液（1∶100），超聲提取30 min，取上清液離心后用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 對照品溶液的制備

分別取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、木蘭花堿、鹽酸黃柏堿適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用鹽酸甲醇溶液（1∶100）溶解并定容，即得對照品儲備液，將其置于4 ℃冰箱中保存，備用。用移液管吸取不同體積的各對照品溶液，于10 mL量瓶中混合后定容，得到不同質量濃度的混合對照品溶液，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis?T3（沃特世公司， 250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）和0.3%磷酸-0.3%三乙胺溶液（B）；梯度洗脫：0～25 min，10%～25% A；25～40 min；25%～40% A；40～55 min，40%～95% A；55～65 min，95% A；柱溫20 ℃；體積流量0.8 mL/min；波長230 nm；進樣量2 μL；黃柏和關黃柏的高效液相色譜圖如圖1所示。

2.4 特征圖譜建立

2.4.1 精密度考察 按“2.1”項下供試品溶液制備方法，制備同一份樣品（HB-1）溶液，吸取2 μL，按“2.3”項下的色譜條件連續進樣6次分析，記錄其色譜圖。以9號峰（鹽酸小檗堿）為參照，計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積，各共有峰相對保留時間的RSD小于1.35%，各色譜峰相對峰面積的RSD中，只有3號峰略大于3.00%，為3.04%，其余均小于3.0%，說明該方法精密度良好。

1-鹽酸黃柏堿 2-木蘭花堿 8-鹽酸藥根堿 9-鹽酸小檗堿 10-鹽酸巴馬汀

2.4.2 穩定性考察 取同一供試品（HB-1）溶液，吸取2 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“2.3”項下的色譜條件進樣分析，記錄其色譜圖。以9號峰（鹽酸小檗堿）為參照，計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積，各共有峰相對保留時間的RSD小于1.05%，各共有峰相對峰面積的RSD小于2.88%，該方法穩定性良好。

2.4.3 重復性考察 取同一樣品（HB-1），按“2.1”項下樣品溶液制備方法，平行制備樣品溶液6份，吸取2 μL，按“2.3”項下的色譜條件連續進樣6次分析，記錄其色譜圖。以9號峰（鹽酸小檗堿）為參照，計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積，各共有峰相對保留時間的RSD小于0.17%，各共有峰相對峰面積的RSD小于2.11%，該方法穩定性良好。

2.4.4 耐用性考察 取同一供試品溶液，分別利用3根不同柱子，在2臺不同儀器按“2.3”項下的色譜條件進行進樣分析并記錄其色譜圖。以9號峰（鹽酸小檗堿）為參照，2號峰和3號峰相對保留時的RSD分別為8.60%和8.34%，其余各色譜峰相對保留時間RSD均小于4.97%，盡管1、2號峰受色譜系統影響較大，但是各色譜峰出峰順序不變。

2.4.5 特征圖譜的建立 按“2.1”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項下色譜條件進行進樣分析，記錄各色譜圖。將色譜圖導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004 A版”進行匹配，并生成黃柏及關黃柏的對照圖譜（圖2）。從特征圖譜可看出，關黃柏中鹽酸小檗堿（9號峰）的峰面積要明顯低于黃柏。黃柏樣品中鹽酸巴馬汀吸收峰強度十分低，并且部分樣品中無法檢出鹽酸巴馬汀。此外，可以看出，黃柏中7號峰的吸收強度大于關黃柏，而2號峰的吸收強度相對較小。即這些成分為鑒別黃柏與關黃柏的關鍵成分，將未知樣品的色譜圖與對照圖譜進行比較，可定性鑒別黃柏和關黃柏。

2.5 PCA與OPLS-DA

2.5.1 PCA 將上述特征圖譜峰面積導入Simia-P 14.1進行PCA，從其得分圖（圖3）可以看出，黃柏與關黃柏之間區分明顯，從而驗證了黃柏與關黃柏之間化學成分差異較大。其載荷圖中，2、7、9、10號峰離原點較遠，表明這些成分對各樣品在得分圖上的分布影響較大，即黃柏和關黃柏中這些成分含量的差異性較大，這些成分可作為鑒別黃柏與關黃柏的標志物。

圖2 對照圖譜對比圖(A) 及黃柏(B) 與關黃柏(C) 特征指紋圖譜

2.5.2 OPLS-DA 將各樣品特征圖譜數據導入到Simca-P 14.1中進行OPLS-DA，得到其得分圖與變量貢獻度圖（Variable important in projection）。其得分圖中（圖4），黃柏與關黃柏分布區分明顯，進一步驗證了黃柏與關黃柏化學成分的差異性，同時，2、7、9、10號峰VIP值較大，其中2號和9號峰VIP值大于1，進一步確認了該4個成分可作為鑒別黃柏與關黃柏的標志物。

2.6 多指標成分的測定

上述已經建立區分黃柏與關黃柏的方法，但其無法區分黃柏樣品質量的優劣，為了對黃柏更好地進行質量控制，在特征圖譜的基礎上，建立了一測多評的方法測定鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸小檗堿3個主要成分含量。其供試品制備、對照品溶液制備、色譜條件分別如“2.1”“2.2”“2.3”項下所示。

圖3 PCA得分圖(A) 與載荷圖(B)

圖4 OPLS-DA得分圖(A)與變量貢獻度圖(B)

2.6.1 精密度、穩定性及重復性試驗 精密度、穩定性及重復性測定方法同“2.4”項，記錄鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸小檗堿3個主要成分的峰面積，并計算其質量分數的RSD值。結果表明，各成分精密度的RSD均小于2.53%、穩定性的RSD值均小于1.68%、重復性的RSD值分別小于1.92%，說明該方法穩定、可靠。

2.6.2 線性方程、定量限與檢測限 將對照品儲備液進行稀釋，制備6份不同質量濃度的混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行分析，以峰面積為縱坐標（），質量濃度為橫坐標（），繪制標準曲線。將對照品溶液進行逐級稀釋，分別以性噪比的3倍和10倍計算檢測限與定量限，結果見表1。

2.6.3 加樣回收率試驗 精密稱取同一樣品（HB1）9份，分別加入鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸小檗堿高、中、低各3份，按“2.1”項下方法制備樣品溶液，并按“2.3”項進行進樣分析，鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸小檗堿加樣回收率在95.0%～106%，RSD小于0.5%，說明該方法準確度良好。

表1 線性方程、檢測限及定量限結果

Table 1 Results of linearity, LOD and LOQ

化合物標準曲線R2線性范圍/(mg·mL?1)檢測限/(mg·mL?1)定量限/(mg·mL?1) 鹽酸黃柏堿Y＝4 733 X＋0.108 80.998 60.005 376～0.336 0000.001 3440.002 688 木蘭花堿Y＝11 966 X－26.3090.998 60.006 368～0.398 0000.001 5920.003 184 鹽酸小檗堿Y＝9 841.2 X＋7.961 70.998 60.005 696～1.78 0000.001 1390.002 848

2.6.4 一測多評方法建立

（1）相對校正因子計算：利用上述線性關系研究中6個不同質量濃度的對照品溶液的分析結果，以鹽酸小檗堿為參照物，按下列公式計算鹽酸黃柏堿和木蘭花堿的相對校正因子（RCF），其中s和x分別表示參照化合物和待測化合物的單位響應值，s、x分別為參照化合物與待測化合物的峰面積，s和x分別為參照化合物和待測化合物的質量濃度。計算得到鹽酸黃柏堿和木蘭花堿的RCF平均值分別為2.071 6、0.822 1，其RSD分別為2.29%、3.00%。

RCF＝s/x＝(s/s)/(x/x)

（2）耐用性考察：分別利用3根不同色譜柱，在2臺不同儀器按“2.3”項下的色譜條件進行進樣分析并記錄同一混合對照品溶液色譜圖。以鹽酸小檗堿（9號峰）為參照，鹽酸黃柏堿和木蘭花堿的RCF平均值分別為2.106 8、0.844 6，其RSD分別為2.43%、0.73%。

2.6.5 樣品含量測定 所有樣品按“2.1”制備供試品溶液，并按“2.3”項色譜條件重復進樣3次分析，按一測多評法計算含量，取平均值，各批次樣品含量測定結果如表2所示，各批次黃柏中鹽酸小檗堿的含量差異較大，為2.34%～6.89%，其質量分數明顯高于關黃柏（0.77%～1.74%）。除了樣品HB-11為異常樣品外，其余各批次黃柏中總生物堿量（以鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸小檗堿計）為3.21%～7.70%，明顯高于關黃柏（1.09%～2.83%）。利用這些特征也可以鑒別黃柏與關黃柏，該實驗結果也說明黃柏和關黃柏中主要化學成分均為生物堿，其中鹽酸小檗堿含量最高，但是各批次黃柏樣品中鹽酸小檗堿含量差異大，為保證黃柏臨床用藥的有效性，有必要對黃柏中鹽酸小檗堿的含量進行限定。

表2 各成分含量測定結果

Table 2 Content results of each constituent

編號質量分數/% 鹽酸黃柏堿木蘭花堿鹽酸小檗堿合計 HB-10.290.103.563.96 HB-20.260.062.953.27 HB-30.290.113.503.90 HB-40.430.204.805.43 HB-50.470.185.015.66 HB-60.270.073.503.83 HB-70.360.153.113.62 HB-80.360.074.104.54 HB-90.580.176.156.90 HB-100.390.094.575.05 HB-110.240.072.342.66 HB-120.610.206.267.07 HB-130.570.185.756.50 HB-140.560.205.636.39 HB-150.580.085.436.10 HB-160.440.064.334.83 HB-170.500.115.045.65 HB-180.370.054.584.99 HB-190.590.136.186.90 HB-200.690.126.897.70 HB-210.480.194.495.15 HB-220.620.295.786.69 HB-230.430.064.675.16 HB-240.300.042.873.21 HB-250.190.033.203.42 HB-260.490.234.605.31 HB-270.560.295.336.18 GHB-10.270.821.742.83 GHB-20.240.851.452.54 GHB-30.180.650.811.64 GHB-40.230.651.182.06 GHB-50.200.471.362.03 GHB-60.130.190.771.09

3 討論

針對市場和臨床應用中黃柏與關黃柏存在混用的情況，本實驗建立了能區分鑒別黃柏與關黃柏的特征圖譜，并結合PCA和OPLS-DA，確認了黃柏和關黃柏的差異性化合物為木蘭花堿（2號峰）、鹽酸小檗堿（9號峰）、鹽酸巴馬汀（10號峰）以及一未知化合物（7號峰），通過分析特征圖譜中這些化合物的色譜吸收強度可準確鑒別黃柏和關黃柏。

此外，本實驗建立的一測多評方法可有效測定黃柏和關黃柏中主要有效成分鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿和木蘭花堿的含量。27批次黃柏樣品中三者的質量分數分別為2.34%～6.89%、0.19%～0.69%和0.03%～0.29%。黃柏中鹽酸小檗堿的含量明顯高于關黃柏，其3個生物堿的總含量也相對較高。鑒于黃柏和關黃黃柏中主要有效成分生物堿存在較大差異，兩者的臨床療效應該也有所不同，因此，在臨床用藥中，黃柏和關黃柏應區別使用。

目前對單一成分的含量測定已經難以滿足質量控制的需求，在中藥或植物藥的質量控制中，國際上主流藥典標準均強調對其中的多指標成分進行含量測定，此外，中藥基原復雜，中藥要想被國際主流藥典認可并走進國際市場，就必須建立合適的方法對齊其同源近屬品種進行區分。本實驗建立的黃柏特征圖譜及一測多評法能夠在有效的區分其易混淆品種關黃柏的同時，對其多指標活性生物堿進行含量測定，本研究可為黃柏的現代化和國際化提供參考依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality control ofbased on HPLC characteristic fingerprint and single standard to determine multi-components method

YUAN Han-wen1, LYU Meng-ying1, LUO Jiang-yi1, QIU Yi-xing1, LIU Yang1, 2, PENG Cai-yun1, WANG Wei1

1. TCM and Ethnomedicine Innovation & Development International Laboratory, Innovative Material Medical Research Institute, School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Hunan Institute for Food and Drug Control, Changsha 410001, China

To establish HPLC characteristic fingerprint and single standard to determine multi-components methods to effectively distinguish Huangbai () from its confusing species,, so as to promote the efficacy and safety of.HPLC was used to analyze the chemical components from. The chromatographic conditions were optimized, the best chromatographic conditions were determined, and then the characteristic chromatogram was established. The differential compounds were screened and confirmed through PCA and OPLS-DA based on characteristic chromatogram data. Berberine hydrochloride was used as the reference compound to establish a single standard to determine multi-components method for the determination of the main effective components in.The established characteristic profile and the multiple evaluation methods were able to identifyand. Magnoflorine, palmatine hydrochloride, berberine hydrochloride and one unknown compound were identified to be the differential compounds. The level of berberine hydrochloridee was significantly higher inthan in. Berberine hydrochloride was not detected in, but its peak area was high in. The level of magnoflorine inis lower than that in, contrary to the peak area of the unknown compound (peak 7).The methods developed herein were simple and crudible for the discrimination ofand. They therefore can be the references for improving the quality control standard of Chinese Pharmacopoeia when revising the Chinese Pharmacopoeia.

;; characteristic fingerprint; quantitative analysis of multi-components by single marker; quality control; magnoflorine; palmatine hydrochloride; berberine hydrochloride

R286.2

A

0253 - 2670(2022)17 - 5491 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.026

2022-02-16

國家重點研發計劃中醫藥現代化研究重點專項-中藥國際標準示范研究（2018YFC1707900）；長沙市自然科學基金資助項目（kq2014086）；湖南省科學技術廳重點研發計劃項目（2018SK2119）；湖南省自然科學基金資助項目（2020JJ4064）

袁漢文（1994—），男，助教，研究方向為中藥化學與分析。Tel: 18711103975 E-mail: hanwyuan@hnucm.edu.cn

彭彩云（1972—），女，教授，碩士生導師，主要從事天然產物化學成分與活性研究。E-mail: caiyunpeng-hucm@qq.com

王 煒（1972—），男，教授，博士生導師，研究方向為中藥化學與資源。E-mail: wangwei402@hotmail.com

[責任編輯 時圣明]