基于ITS2 DNA序列的雷公藤屬藥材資源譜系地理學研究

勵 娜，王 丹，陳一龍，姚媛媛，張小梅*，李勝容*

基于ITS2 DNA序列的雷公藤屬藥材資源譜系地理學研究

勵 娜1, 2，王 丹1, 2，陳一龍1, 2，姚媛媛3，張小梅1, 2*，李勝容1, 2*

1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065 2. 重慶市中藥研究院 重慶市中藥藥學評價工程技術研究中心，重慶 400065 3. 嘉興學院生物與化學化工學院，浙江 嘉興 314001

采用ITS2 DNA條形碼技術，研究雷公藤屬3種藥用植物的遺傳特性，揭示其地理分布格局的形成原因。收集雷公藤屬植物28個居群223份樣本，提取基因組DNA，擴增ITS2基因序列并測序，并進行遺傳多樣性分析，繪制失配分布曲線檢測群居歷史動態變化情況，估算雷公藤屬種間、種內群體間和群體內的差異及遺傳分化系數。雷公藤屬28個居群223份樣本共檢測到12個堿基突變位點，構成10個單倍型。昆明山海棠共有7個單倍型，H2～H7為特有單倍型；雷公藤共有4個單倍型，H8為特有單倍型；東北雷公藤共有3個單倍型，無特有單倍型；H1為3個物種間的共有單倍型，H9和H10為雷公藤和東北雷公藤共有單倍型。群體遺傳多樣性分析顯示，雷公藤屬具有較高的單倍型多態性（d＝0.615±0.024）和核苷酸多態性[i＝（9.47±0.58）×10?3]。群體遺傳結構分析顯示，雷公藤屬的變異主要存在于物種之間（76.14%），種內群體間和群體內的變異分別為11.42%、12.44%。群體動態歷史分析表明，雷公藤屬、雷公藤和東北雷公藤曾經歷過擴張，而昆明山海棠未經歷過擴張。雷公藤屬及其屬下的昆明山海棠和雷公藤的遺傳多樣性水平較高，而東北雷公藤遺傳多樣性水平較低。雷公藤屬植物在第4紀冰期時，將中國西南、華中和華東的部分地區作為冰期避難所，冰期后以冰期避難所為中心向四周擴散，形成當前雷公藤屬植物的分布格局。

雷公藤屬；昆明山海棠；雷公藤；東北雷公藤；ITS2序列；譜系地理學；遺傳特性

第4紀冰期的氣候震蕩顯著改變了北半球溫帶地區的大多數物種的地理分布，產生了不同程度的范圍擴展和收縮，影響了種群內部和種群間遺傳變異的地理格局[1-2]。近年，基于DNA條形碼技術的分子譜系地理學是國際上研究居群遺傳分化進化歷史的熱點和亮點[3]。分子譜系地理學研究技術在藥用植物遺傳多樣性、歷史進化、地理分布格局歷史成因和資源保護等方面的研究中發揮著日益重要的作用[4-5]。ITS2基因序列常用于植物屬間、種間甚至居群間的系統關系探究，對于植物居群的動態結構、歷史事件的發生過程有清晰的認識，能全面的反應居群的進化歷史[6-7]。

我國傳統藥用植物昆明山海棠(Lévl.) Hutch.和雷公藤Hook均屬于衛矛科（Celastraceae）雷公藤屬L.植物，同屬植物還包括東北雷公藤Sprague et Takeda，其中前兩者廣泛分布于我國長江中、下游以南及西南地區，后者主要分布于我國東北地區[8]。作為自身免疫性疾病臨床常用中藥，昆明山海棠與雷公藤植物藥材目前主要采自野生，經過近30年的開發利用和適生環境被侵占，呈現資源銳減、供應嚴重匱乏等現象，甚至部分地區面臨資源枯竭的危險[9-10]。因此，本研究旨在通過分析我國雷公藤屬植物28個居群223份個體的ITS2的序列變異，闡明雷公藤屬植物遺傳特性及地理分布格局的歷史成因，以期為該屬植物的資源保護策略的制定提供一定的參考。

1 材料

1.1 藥材

本研究共收集3種雷公藤屬植物28個居群223份樣本，經重慶市中藥研究院瞿顯友研究員分別鑒定為昆明山海棠(Lévl.) Hutch.、雷公藤Hook和東北雷公藤Sprague et Takeda的干燥根。具體信息見表1。

表1 樣品來源

Table 1 Source of samples

編號品種產地海拔/m經度緯度 S1昆明山海棠四川米易普威2226E101°59′31″N27°03′33″ S2四川米易橫山1824E102°00′40″N26°59′26″ S3四川德昌1772E102°08′21″N27°23′44″ S4四川冕寧林里1624E102°11′57″N28°22′43″ S5四川冕寧石龍1840E102°12′14″N28°31′21″ S6云南南華2507E101°01′23″N25°19′30″ S7云南大理2450E100°07′31″N25°41′59″ S8云南南澗1696E100°32′51″N24°48′37″ S9云南保山2280E99°06′58″N25°07′30″ S10貴州雷山1160E108°13′43″N26°25′07″ S11貴州劍河 811E108°33′18″N26°37′58″ S12貴州印江 873E108°36′48″N27°56′27″ S13重慶武隆1589E107°42′24″N29°30′23″ S14重慶石柱1580E108°23′01″N30°13′23″ S15重慶江津1164E106°26′06″N28°36′21″ S16湖南南岳 764E112°38′18″N27°14′06″ S17湖南新寧1094E110°54′04″N26°26′07″ S18湖南武岡1415E110°37′21″N26°39′02″ S19湖北利川 738E108°39′50″N30°25′25″ S20雷公藤湖北通城 152E113°45′37″N28°07′20″ S21浙江龍泉1208E118°58′14″N28°05′21″ S22江西灣里 168E115°43′10″N28°48′29″ S23江西婺源 60E117°32′45″N29°05′40″ S24江西修水 152E114°02′41″N28°55′40″ S25東北雷公藤吉林通化 650E126°04′26″N41°34′02″ S26吉林江源1024E126°42′09″N41°55′39″ S27吉林臨江 739E126°55′20″N41°50′11″ S28吉林池北1090E128°10′59″N42°11′07″

1.2 試劑與儀器

植物基因組DNA試劑盒，天根生化科技有限公司；TIANGel Midi純化試劑盒，天根生化科技有限公司；UV-1100 SPECTROPHOTMETER，MAPADA有限公司；BP121S型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；AEG-45SM型電子天平，日本島津公司；BJ-100型多功能粉碎機，德清拜杰電器有限公司；KQ250DB型數控超聲波清洗器，鞏義市予華儀器有限公司；HH-S24型恒溫水浴鍋水浴鍋，金壇梅香儀器有限公司；SCIENTZ-48 DNA提取研磨機；9700 GeneAmp PCR儀，Applied Biosystems公司；ABI 3730XL測序儀，Applied Biosystems公司。

2 方法

2.1 DNA提取、擴增和測序

根據植物基因組DNA試劑盒說明書提取上述28個居群223份雷公藤屬植物樣本總基因，參考Chen等[11]操作步驟進行PCR擴增。ITS2引物序列：正向為5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’；反向為5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。采用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，并使用TIANGel Midi試劑盒進行純化。使用ABI 3730XL測序儀對純化后的樣品進行測序。

2.2 遺傳多樣性分析

使用DnaSP v5軟件確定雷公藤屬3個物種28個居群ITS數據的單倍型，并統計多態位點和信息位點的數目，計算群體單倍型多樣性（haplotype diversity，d）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，i）。

2.3 群體遺傳結構分析

使用PERMUT軟件計算雷公藤屬的遺傳分化參數（st、st），并檢驗差異的顯著性。使用Arlequin3.5軟件進行分子方差分析（AMOVA）估算屬內種間、種內群體間和群體內的差異，以及種間和群體間遺傳分化系數。

2.4 中性檢驗

使用DnaSP v5軟件計算中性檢驗統計值Tajima’s（值）和Fu’（值）。中性學說認為分子水平上的突變大多是中性或接近中性，對生物體的生存不存在任何有利或不利影響，且不受自然選擇的影響。突變是自然種群隨機遺傳漂變的結果，因此，核酸替換率只與它的突變率相關，它們概率是相等的。通過檢驗來判斷這些位點是否符合中性進化模式。如果值為負值，說明種群內存在大量低頻率的等位基因，暗示著種群曾經經歷過擴張和或凈化選擇；如果值為正，則說明種群內中等頻率的等位基因較多，那么種群可能經歷過瓶頸效應和或平衡選擇。值亦如此。但是值反映的是群體動態的古老事件，而值反映的則是近期發生的群體動態。

2.5 失配分析

失配分布是檢測群體大小變化的一種方法，可以推測群體是否經歷過快速擴張事件。失配分布檢驗主要是將種群中的任意兩個序列進行比較進而得到兩個序列間差異的分布情況，其結果可用于計算雷公藤屬各水平類群在歷史上的種群動態。通過觀察值與模擬值間的離差平方和和反映擬合曲線平滑度的RAG值，可以判斷雷公藤屬種群是否經歷過種群擴張或是瓶頸效應。因為種群大小如果長期保持穩定的話，那么它的分布曲線應該出現至少2個峰值，而經歷過快速擴張的種群則會呈現為泊松分布。用DnaSP v5軟件繪制失配分布曲線，用Arlequin 3.5計算相關參數。

2.6 單倍型網絡圖分析

以獨子藤Roxb.作為外類群，利用Network構建基于Median joining算法的單倍型網絡圖，并對該圖進行手工調整。

2.7 單倍型系統發育樹

使用Modeltest 3.7軟件對ITS2單倍型序列進行計算，以得到DNA序列替代模型的最佳模型。利用MrBayes 3.1.2軟件對ITS2序列數據進行貝葉斯分析，構建以獨子藤為外類群的雷公藤屬的單倍型系統樹。

3 結果與分析

3.1 ITS2序列變異分析和單倍型分布

雷公藤屬3個物種28個群體223份樣本成功擴增出223 bp ITS2序列，共檢測到12個變異位點（Variable/polymorphic sites），全為堿基突變，共有11個信息位點（parsimony informative sites）（表2）。12個變異位點構成了10個單倍型（H1～H10）。昆明山海棠共有7單倍型，其中6個為特有單倍型（H2～H7）；雷公藤共有4單倍型，其中1個為特有單倍型（H8）；東北雷公藤共有3單倍型，無特有單倍型；3個物種之間，H1是3個物種共有單倍型，H9和H10為雷公藤和東北雷公藤共有單倍型；除開H1，東北雷公藤和昆明山海棠之間、昆明山海棠和雷公藤之間再無其他共有單倍型（表3）。

表2 雷公藤屬10種單倍型和12個變異位點

Table 2 Ten haplotypes and 12 variant sites of Tripterygium

類型變異位點 123456789101112 H1GGAAGTCATCCT H2?A?????????? H3??????????T? H4A?????T????? H5??????T????? H6?????CT????? H7?????C?????? H8??G????????? H9???T???GCT?A H10????A???????

表3 雷公藤屬物種的單倍型多態性、核酸多態性和單倍型分布

Table 3 Haplotype polymorphism, nucleic acid polymorphism and haplotype distribution in Tripterygium

編號單倍型數量HdPi /(×10?3)單倍型種類及頻次 S01130.410±0.154 1.95±0.90H1(10)、H2(2)、H3(1) S02120.485±0.106 2.17±0.48H1(8)、H2(4) S03 90.000±0.000 0.00±0.00H1(9) S04120.000±0.000 0.00±0.00H1(12) S05 70.000±0.000 0.00±0.00H1(7) S06100.000±0.000 0.00±0.00H1(10) S07110.327±0.153 2.94±1.38H1(9)、H4(2) S08110.000±0.000 0.00±0.00H1(11) S09110.000±0.000 0.00±0.00H1(11) S10110.000±0.000 0.00±0.00H5(11) S11110.000±0.000 0.00±0.00H5(11) S12 50.000±0.000 0.00±0.00H5(5) S13120.485±0.106 2.17±0.48H1(4)、H2(8) S14130.000±0.00 0.00±0.00H5(13) S15120.409±0.133 1.83±0.60H1(3)、H5(9) S16120.000±0.000 0.00±0.00H1(12) S17 60.000±0.000 0.00±0.00H1(6) S18 31.000±0.272 5.98±1.99H1(1)、H6(1)、H7(1) S19 60.000±0.000 0.00±0.00H1(6) S20 80.000±0.000 0.00±0.00H1(8) S21100.000±0.000 0.00±0.00H8(10) S22150.590±0.07712.13±1.55H1(8)、H9(6)、H10(1) S23100.000±0.000 0.00±0.00H1(10) S24 90.000±0.000 0.00±0.00H1(9) S25100.000±0.000 0.00±0.00H9(10) S26180.000±0.000 0.00±0.00H9(18) S27200.468±0.10410.36±2.12H1(5)、H9(14)、H10(1) S28180.000±0.000 0.00±0.00H9(18)

3.2 群體遺傳多樣性分析

雷公藤屬28個群體共檢測到12種單倍型，每個群體的單倍型及個體數見表3。在28個群體中，8個群體具有單倍型多態性，其中4個群體具有2種單倍型，4個群體具有3種單倍型，無群體具有3個以上的單倍型。如表4所示，雷公藤屬具有較高的單倍型多態性（d＝0.615±0.024）和核苷酸多態性[（i＝9.47±0.58）×10?3]，在物種水平上3個物種的多態性水平均小于雷公藤屬多態性水平，d的變化范圍為（0.170±0.060）（東北雷公藤）～（0.506±0.069）（雷公藤），i的變化范圍為（2.22±0.21）×10?3（昆明山海棠）～（6.26±1.51）×10?3（雷公藤）。群體水平上，d的變化范圍為（0.327±0.153）（大理）～（1.000±0.272）（武岡），i的變化范圍為（1.83±0.60）×10?3（江津）～（12.13±1.55）×10?3（南昌）。

表4 雷公藤屬群體的單倍型多態性、核酸多態性和單倍型分布

Table 4 Haplotype polymorphisms, nucleic acid polymorphisms, and haplotype distribution in Tripterygium

樣本單倍型數量HdPi/(×10?3) 昆明山海棠1870.448±0.0352.22±0.21 雷公藤 520.506±0.0696.26±1.51 東北雷公藤 660.170±0.0603.90±1.36 雷公藤屬2230.615±0.0249.47±0.58

3.3 群體遺傳結構

AMOVA分析顯示，雷公藤屬的變異主要存在于物種之間（76.14%），種內群體間和群體內的變異分別為11.42%、12.44%。物種水平上，雷公藤的變異在群體間和群體內差異不大，分別為47.66%和52.34%；昆明山海棠的變異主要存在于群體間（65.54%），群體內的變異為34.46%；東北雷公藤的變異主要存在于群體內（76.64%），群體間的變異為23.36%（表5）。

表5 雷公藤屬分子變異分析(AMOVA)

Table 5 Molecular variation analysis of Tripterygium(AMOVA)

樣本 變異來源自由度平方和變異百分比/%F值 雷公藤屬物種間2211.05976.14FCT=0.761 36 種內群體間2554.11211.42FSC=0.478 64 群體內27755.68812.44FST=0.875 58 東北雷公藤群體間36.30823.36 群體內6221.95076.64FST= 0.233 61 昆明山海棠群體間1831.14265.54FST= 0.655 44 群體內16814.80534.46 雷公藤群體間416.66347.66FST= 0.476 56 群體內4718.93352.34

3.4 群體動態歷史分析

分別在屬水平、物種水平進行值和值中性檢驗（表6），結果顯示值和值的正負不一，均未到達顯著水平，因此不能拒絕中性假說。說明雷公藤屬在屬水平和物種水平均未經歷過群體擴張或瓶頸事件。

分別對雷公藤屬以及3個物種進行了失配分布檢驗（表6）。雷公藤屬水平上，SSD＝0.072 78，＝0.19，RAG＝0.156 17，＝0.32，不能拒絕擴張假說。物種水平上，雷公藤和東北雷公藤的SSD和RAG的值都不顯著，不能拒絕擴張假說；而昆明山海棠的SSD的值顯著，RAG的值不顯著，從SSD的結果看需要拒絕擴張假說，而從RAG的結果看，不能拒絕擴張假說，結果不一致。另外從失配分布曲線看，雷公藤屬、雷公藤和東北雷公藤的觀察曲線為雙峰，而昆明山海棠呈現的是比較完整的單峰分布，說明雷公藤屬、雷公藤和東北雷公藤曾經經歷過擴張，而昆明山海棠未經歷過擴張（圖1）。

中性檢驗、失配分析的曲線以及SSD和RAG分析對雷公藤屬、昆明山海棠、雷公藤和東北雷公藤的群體動態結果不一致，可能是由于ITS2一個片段的信息位點太少導致，需要進一步增加片段進行分析。

3.5 單倍型網絡圖分析

如圖2所示，單倍型網絡圖分析顯示雷公藤屬的10個單倍型構成一個星狀的拓撲結構，其中單倍型H1和H5處于星狀結構的中心，與其他單倍型具有最近的親緣關系，說明H1和H5是最原始的單倍型。根據星狀的拓撲結構，雷公藤屬10個單倍型大致可以分成3個支系，其中2個支系分別以H1和H5為祖先單倍型，H9單獨成為一個分支構成一個支系。

結合單倍型分布圖分析發現，單獨為一個支系的單倍型H9為東北雷公藤獨有單倍型，4個東北雷公藤群體均有該單倍型，因此H9的分布與東北雷公藤的分布范圍一致，在我國東北部。以H5為祖先單倍型的支系，主要分布在云南北部、貴州、重慶南部和湖南西部地區，該支系為昆明山海棠所獨有。剩余單倍型的以H1為祖先單倍型，雷公藤屬的3個物種都有該支系的單倍型，分布范圍最為廣闊。

表6 雷公藤屬中性檢驗和失配分析結果

Table 6 Tripterygium neutrality test and mismatch analysis results

樣本SSDP值HRAGP值F值P值D值P值 雷公藤屬0.072 780.190.156 20.32 0.812 360.692 0.249 730.638 雷公藤0.040 260.140.160 90.49 1.927 540.850?0.259 580.474 東北雷公藤0.033 030.060.717 60.67 1.917 660.819?0.748 920.249 昆明山海棠0.008 700.040.152 90.11?3.201 470.070?0.825 290.245

圖1 雷公藤屬失配分布分析

圖2 雷公藤屬單倍型網絡局部圖

3.6 單倍型系統發育樹

使用貝葉斯法構建的雷公藤屬系統發育樹見圖3，該系統樹中多數分支的支持率很低，其中H5、H4和H6構成的分支的支持率超過0.5，與單倍型網絡圖結果相似。系統樹中，H9依然是單獨夠成一支，與單倍型網絡圖的結果也類似。與單倍型網絡圖結果不一樣的是在系統發育樹中剩余單倍型并未獨聚為一支，而是與H5、H4和H6一起構成一個支持率為0.53的分支，而H7和H8未與他們聚在一起。

圖3 雷公藤屬單倍型系統發育樹

4 討論

4.1 群體遺傳多樣性

在屬水平上，雷公藤屬具有較高的遺傳多樣性，d為0.615±0.024，i為（9.47±0.58）×10?3；物種水平上，雷公藤屬3個物種遺傳多樣性水平具有一定的差異，其中d由高到低依次為雷公藤（0.506±0.069）、昆明山海棠（0.448±0.035）、東北雷公藤（0.170±0.060）；與雷公藤屬屬水平遺傳多樣性相比，物種水平的遺傳多樣性較低。雷公藤屬及其屬下2個種昆明山海棠和雷公藤的遺傳多樣性水平較高，而東北雷公藤遺傳多樣性水平較低。東北雷公藤遺傳水平低的原因可能有2種，一個是第4紀冰期時，東北雷公藤已經擴散到我國東北地區，在冰期時群體收縮由于嚴重的遺傳漂變導致群體遺傳多樣性下降。第2個是東北雷公藤在擴散到東北時，由于建群者效應導致當前的群體遺傳多樣性水平較低。

4.2 群體遺傳結構

群體遺傳結構方面，雷公藤屬3個物種群體水平的遺傳多樣性都很低。屬水平上，28個群體中只有8個群體具有遺傳多樣性。物種水平上，5個雷公藤群體只有1個群體具有遺傳多樣性，19個昆明山海棠群體只有6個群體具有遺傳多樣性，4個東北雷公藤群體只有1個群體具有遺傳多樣性。AMOVA分析顯示，雷公藤屬的變異主要存在于物種之間（76.14%），雷公藤屬物種間分化顯著。物種水平上，雷公藤的變異在群體間和群體內差異不大；昆明山海棠的變異主要存在于群體間；東北雷公藤的變異主要存在于群體內。Hamrick等[12]的研究認為，在物種水平上植物群體遺傳多樣性水平主要收到系統分類地位、分布范圍、生活型、繁育系統和種子散播機制等因素的影響，群體水平上主要受到繁育系統、分布范圍、生活史、分類地位和種子的散播機制等因素的影響。根據Hamrick和Godt理論，多年生、異交為主、風媒或水媒擴散種子的植物群體間的分化程度較低，相反長壽的、自交為主的植物群體間的分化程度較高。

4.3 冰期避難所

氣候波動對植物地理分布格局的影響非常大，第4紀冰期是對當前我國植物地理分布格局影響最大的一次歷史氣候[13-14]。在第4季冰期時，亞洲、美洲和歐洲都有明顯的大陸冰川，但是在我國范圍內沒有明顯的大陸冰川，只有部分山地冰川[15]。冰期避難所是指在冰期尤其是盛冰期時，許多物種分布范圍收縮后生存下來的區域[16]。避難所區域的群體比其他區域群體的遺傳多樣性高，根據這一特性及雷公藤屬單倍型分布格局，認為在第4紀冰期時，云南北部及四川南部的橫斷山脈、重慶的大巴山脈、湖南南部的南嶺和江西北部的廬山是雷公屬植物的冰期避難所。

云南北部及四川南部地處我國橫斷山脈，橫斷山脈地區位于青藏高原東南部外圍，地質構造上十分活躍。該區域具有復雜的種子植物區系和豐富的特有種，是潛在的第4季冰期避難所[17]。大巴山脈具有山高、坡陡、谷深的地貌特點。秦巴山地是北部冷空氣南下的重要屏障，使得這一地區保存有第3紀植物最具豐富性和完整性[18]。周先容等[19-20]研究指出大巴山、武陵山、神農架地區具有較大比例的古特有屬和珍稀瀕危物種，無遺是古植物區系的重要避難所。南嶺地區是熱帶和亞熱帶的過度地區，長期保持濕熱的氣候環境，對中生代和新生代的植物進化起著重要的作用。該區域中國特有種在總種數中占比高達59.9%，也是動植物第4紀冰期的避難所。周秉根等[21-22]對揚子鱷的研究認為第四紀冰期是華中地區的中低山系（包括黃山、廬山、九華山和天目山等）不具備發育冰川的條件，而是季風性冰緣環境且為溫暖帶氣候，很可能是第4紀冰期避難所。

結合雷公藤屬植物單倍型分布圖和單倍型網絡圖分析發現，雷公藤屬植物具有中國西南至華中，然后到華東，最后擴散到東北的歷史遷移路線。筆者認為，雷公藤屬植物在第4紀冰期時以云南北部及四川南部的橫斷山脈、重慶的大巴山脈、湖南南部的南嶺和江西北部的廬山作為冰期避難所，冰期后以冰期避難所為中心向四周擴散，形成當前雷公藤屬植物的分布格局。

4.4 資源狀況分析

雷公藤屬藥用植物資源目前主要來自野生，其中昆明山海棠分布面積較雷公藤和東北雷公藤更廣，野生資源較為豐富，在四川涼山等地成片生長，但由于過度開采及存在大量紫莖澤蘭惡性競爭其適生環境，其蘊藏量已急劇減少。雷公藤多以散生為主，在本次實地取樣過程種未見大面積群落，一個地方僅有幾株、幾十株，重復取樣具有一定困難。且雷公藤喜陰濕，但需要一定陽光，郁閉度稍高，長勢就變弱。現華東地區嚴禁砍伐木材后，山區森林郁閉度增高，雷公藤長勢漸弱，進一步不利于雷公藤的生長繁殖。東北雷公藤的群落主要集中在長白山地區。由于其尚未開發利用，野生資源還未被破壞，但分布區較小，資源蘊藏總量不多。

綜上所述，基于ITS2基因序列對雷公藤屬藥用植物譜系地理學研究結果表明，該屬植物具有較高的遺傳多樣性，其下的3個物種群體水平的遺傳多樣性都很低。在第4紀冰期時以云南北部及四川南部的橫斷山脈、重慶的大巴山脈、湖南南部的南嶺和江西北部的廬山作為冰期避難所，冰期過后以冰期避難所為中心向四周擴散，形成當前雷公藤屬植物的分布格局。資源現狀分析提示雷公藤屬藥用植物野生資源匱乏，后續課題組將就此進一步提出雷公藤屬藥用植物資源保護和可持續發展策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Li Q E, Guo X, Niu J F,. Molecular phylogeography and evolutionary history of the endemic species(Papaveraceae) on the Tibetan Plateau inferred from chloroplast DNA and ITS sequence variation [J]., 2020, 11: 436.

[2] Hewitt G. The genetic legacy of the Quaternary ice ages [J]., 2000, 405(6789): 907-913.

[3] 卓維, 劉艷, 白娟, 等. 基于nrDNA ITS序列的榧樹屬植物鑒定及親緣關系分析 [J]. 分子植物育種, 2021, 19(11): 3579-3587.

[4] 李菁, 向婷婷, 許成, 等. 分子譜系地理學在藥用植物基因水平的研究進展 [J]. 中草藥, 2015, 46(8): 1243-1246.

[5] 劉曉光, 黃璐琦, 袁慶軍, 等. 基于分子譜系地理學的藥用植物核心種質構建 [J]. 中國中藥雜志, 2012, 37(5): 692-698.

[6] 楊俊譽, 魏世杰, 蘇代發, 等. 云南黃毛草莓的nrDNA ITS和cpDNA psbA-trnH序列分子鑒定及進化特征分析 [J]. 南方農業學報, 2020, 51(4): 748-757.

[7] 張雪梅, 何興金. 青藏高原特有植物青海當歸的譜系地理學初探 [J]. 植物分類與資源學報, 2013, 35(4): 505-512.

[8] 中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志（第六卷第一分冊, 蕨類植物門）[M]. 北京: 科學出版社, 1999: 178.

[9] 王特, 李兆福, 李濤, 等. 昆明山海棠治療類風濕關節炎作用機制的研究進展 [J]. 風濕病與關節炎, 2019, 8(8): 60-63.

[10] 徐娥, 任慧珠. 小劑量雷公藤多甙對早期糖尿病腎病患者的臨床療效觀察 [J]. 實用糖尿病雜志, 2020, 16(3): 57-58.

[11] Chen S L, Yao H, Han J P,. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species [J]., 2010, 5(1): e8613.

[12] Hamrick J L, Godt M J W.[M]. Massachusetts: Sinauer Associates Inc, 1990.

[13] Qiu Y X, Fu C X, Comes H P. Plant molecular phylogeography in China and adjacent regions: Tracing the genetic imprints of Quaternary climate and environmental change in the world’s most diverse temperate flora [J]., 2011, 59(1): 225-244.

[14] Hewitt G M. Genetic consequences of climatic oscillations in the Quaternary [J]., 2004, 359(1442): 183-195.

[15] Zhao C, Wang C B, Ma X G,. Phylogeographic analysis of a temperate-deciduous forest restricted plant (Turcz.) reveals two refuge areas in China with subsequent refugial isolation promoting speciation [J]., 2013, 68(3): 628-643.

[16] 沈浪, 陳小勇, 李媛媛. 生物冰期避難所與冰期后的重新擴散 [J]. 生態學報, 2002, 22(11): 1983-1990.

[17] 陳冬梅, 康宏樟, 劉春江. 中國大陸第四紀冰期潛在植物避難所研究進展 [J]. 植物研究, 2011, 31(5): 623-632.

[18] 趙芳, 張百平, 朱連奇, 等. 秦巴山地垂直帶譜結構的空間分異與暖溫帶—亞熱帶界線問題 [J]. 地理學報, 2019, 74(5): 889-901.

[19] 周先容, 尚進, 陳發波, 等. 巴山榧樹及近緣種的psbA-trnH序列分析 [J]. 西部林業科學, 2015, 44(1): 16-21.

[20] 周先容, 汪建華, 尚進, 等. 金佛山喀斯特山地巴山榧樹灌叢群落優勢灌木種群的種間關系 [J]. 西南大學學報: 自然科學版, 2016, 38(9): 88-94.

[21] 周秉根, 盧曉. 揚子鱷如何渡過第四紀冰期 [J]. 華中師范大學學報: 自然科學版, 1994, 2: 260-262.

[22] 周秉根, 李剛, 姚敏, 等. 九華山第四紀冰緣地貌與古環境分析 [J]. 安徽師大學報: 自然科學版, 1994, 17(2): 48-53.

Phylogeography ofinferred based on ITS2 DNA sequence variation

LI Na1, 2, WANG Dan1, 2, CHEN Yi-long1, 2, YAO Yuan-yuan3, ZHANG Xiao-mei1, 2, LI Sheng-rong1, 2

1. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China 2. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing 400065, China 3. College of Biological, Chemical Science and Engineering, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China

To studythe genetic characteristics and geographical distribution of three species of the genusby ITS2 DNA barcoding technique.A total of 223 samples from 28 populations ofwere collected. The genomic DNA extraction and ITS2 gene amplification and sequencing were performed on the above samples. Genetic diversity was analyzed by calculating haplotype diversity and nucleotide diversity. The dynamic change of social history was detected by drawing the curve of mismatch distribution. Based on the above data analysis, the differences among species, populations and populations, and the coefficient of genetic differentiation between species and populations were estimated.A total of 12 base mutation sites were detected in 223 samples from 28 populations of, which constituted 10 haplotypes. There were seven haplotypes in, and H2—H7 were unique haplotypes. There were four haplotypes in, and H8 was a unique haplotype. There were three haplotypes in. Among the three species, H1 is the haplotype of three species, H9 and H10 are the haplotypes ofand. The analysis of population genetic diversity showed thathad high haplotype and nucleotide polymorphism [d= 0.615 ± 0.024,i= (9.47 ± 0.58 )× 10?3] . The analysis of population genetic structure showed that the variation ofmainly existed among species (76.14%), and the variation of intraspecies and intrapopulation was 11.42% and 12.44%, respectively. The population dynamic analysis showed that,andhad experienced expansion, buthad not.The genetic diversity level of,andare higher than that of.used parts of Southwest China, Central China, and East China as refuges during the Quaternary ice age. After the ice age,spread around the refuge, forming the current distribution pattern.

;(Lévl.) Hutch.;Hook;Sprague et Takeda; ITS2 sequence; phylogeography; genetic characteristics

R282.12

A

0253 - 2670(2022)17 - 5476 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.024

2022-02-06

國家重大新藥創制科技專項（2017ZX09101002）；重慶市基礎科學與前沿技術研究項目（cstc2017jcyjAX0001，cstc2018jcyjAX0142）；重慶市社會事業與民生保障科技創新專項（cstc2017shms-zdyfX00012）

勵 娜，主任中藥師，從事中藥資源、質量控制、中藥制劑、中藥炮制工藝及機制研究。E-mail: lina1281@163.com

張小梅，主任中藥師，從事中藥資源與物質基礎研究、中藥品種品種評價、中藥新藥研究。E-mail: 605050963@qq.com

李勝容，主任藥師，從事中藥資源與質量評價、中藥新藥研究開發。E-mail: 1079639273@qq.com

[責任編輯 時圣明]