包載黃芩苷的線粒體靶向糖原納米粒的制備及載藥性能表征

許嘉敏，王軍澤，趙冰可，李文化，陳敬華，邱立朋

·藥劑與工藝·

包載黃芩苷的線粒體靶向糖原納米粒的制備及載藥性能表征

許嘉敏，王軍澤，趙冰可，李文化，陳敬華，邱立朋*

江南大學生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫 214122

合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦［(4-carboxybutyl)triphenylphosphonium bromide，TPP］修飾的糖原（glycogen，Gly）衍生物（Gly-TPP），以其制備包載黃芩苷（baicalin，BA）的糖原納米粒（BA/Gly-TPP NPs），并對其進行制劑學表征。通過酯化反應將TPP連接到Gly上，合成線粒體靶向的樹狀大分子糖原衍生物Gly-TPP，通過核磁共振氫譜、紫外光譜、紅外光譜確定其結構，通過細胞毒性實驗考察其安全性。利用糖原內核包載疏水性藥物黃芩苷，構建線粒體靶向的給藥系統BA/Gly-TPP NPs，考察其粒徑、載藥量、體外釋放、粒徑穩定性等制劑學性質。成功合成的Gly-TPP呈現規則的球形，無細胞毒性。BA/Gly-TPP NPs粒徑分布在70～80 nm，ζ電位為（8.84±0.89）mV，載藥量為（20.67±0.16）%，同時具有良好的釋藥行為。Gly-TPP具有良好的載藥性能，為納米藥物載體系統的設計提供了新思路。

糖原；三苯基膦；黃芩苷；線粒體靶向；藥物遞送

樹枝狀大分子是一類高度枝化的單分散性大分子，其內部結構含大量空腔，外部呈親水性，被稱為單分子膠束，其核心和支端均可連接官能團，作為藥物遞送載體，可顯著增加藥物負載量，改善藥物性能[1-2]。糖原（glycogen，Gly）是一種隨機超支化的納米粒子，由α--(1-4)-葡萄糖單元鏈組成，這些鏈通過α--(1-6)-糖苷鍵相互連接形成中空型樹枝狀結構，可從動植物組織中提取得到，具有良好的生物相容性、生物可降解性[3-4]、高水溶性和易功能化等特點[5-6]。此外，糖原相對分子質量較大，腎臟不易將其直接清除，作為藥物載體時可以有效延長藥物在體內的循環時間[7]。Han等[8]通過席夫堿反應將具有肝癌細胞靶向能力的小分子β-半乳糖和化療藥物阿霉素修飾在糖原納米粒上，結果表明，經修飾后的納米粒有效延長了藥物在體內的循環時間，并且能夠靶向肝癌細胞。然而，目前基于糖原納米粒的藥物遞送系統研究仍在少數，糖原作為藥物載體的優勢尚未充分體現。

(4-羧丁基)三苯基溴化膦［(4-carboxybutyl) triphenylphosphonium bromide，TPP］含正電荷中心，常用來介導藥物、高分子聚合物克服線粒體膜的屏障阻礙，進入線粒體[9-11]。黃芩苷（baicalin，BA）是藥用植物黃芩的主要藥效活性成分之一，具有廣泛的藥理作用[12]，如抗腫瘤[13]、抗菌[14]、抗氧化[15]、抗炎[16]等，但是生物利用度低、不適用于靜脈注射等缺點在一定程度上限制了其臨床應用[17]。已有研究表明，黃芩苷可以通過調節線粒體而實現其藥理藥效[18]，此時，由于靶向線粒體的TPP存在，有利于黃芩苷在線粒體的聚集，從而獲得更好的治療效果。本研究以生物安全性良好的樹狀大分子糖原為基礎，利用其表面豐富的羥基基團與TPP相連，構建具有線粒體靶向功能的糖原納米粒（Gly-TPP NPs）。同時，包載疏水性藥物黃芩苷，得BA/Gly-TPP NPs，考察載藥納米粒的制劑學性質，探索Gly-TPP在藥物遞送領域更為廣泛的應用。

1 儀器與材料

透析袋，截留相對分子質量3500，美國Spectrumlabs公司；FreeZone 2.5L冷凍干燥機，美國Labconco公司；Aduance III核磁共振波譜儀，德國Bruker公司；JEM-2100透射電子顯微鏡（TEM），日本JEOL公司；UV-2550紫外-可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；全反射傅里葉紅外光譜（FT-IR）儀，英國Nicolet公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度儀，英國Malvern儀器有限公司；Multiskan GO酶標儀，美國Thermo公司。

黃芩苷、TPP、,′-二異丙基碳二酰亞胺（,′- diisopropylcarbodiimide，DIC）、4-二甲氨基吡啶（4- dimethylaminopyridine，DMAP），上海麥克林生化科技有限公司；糖原，上海源葉生物科技有限公司；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、,-二甲基甲酰胺（,-dimethylformamide，DMF），國藥集團上海試劑公司；噻唑藍（MTT），上海生工生物工程公司。小鼠成纖維細胞（NIH-3T3），中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

2 方法與結果

2.1 Gly-TPP的合成與表征

Gly-TPP的合成路線如圖1所示，通過一鍋法，在催化劑存在下，糖原結構中的羥基（-OH）與TPP結構中的羧基（-COOH）發生酯化反應，得到Gly-TPP。具體步驟如下：將糖原（3 mmol，500 mg）加入25 mL的圓底燒瓶中，加入8 mL左右DMSO攪拌，直到糖原完全溶解，溶液變得清亮。隨后，加入TPP（3 mmol，1.329 g）、DIC（6 mmol，883.4 mg）和DMAP（6 mmol，855.2 mg），在室溫下，攪拌反應24 h。反應結束后，將反應液置于透析袋中，在攪拌的1 L蒸餾水中透析3 d，每隔4 h更換透析水，隨后將透析袋內溶液凍干，得到的白色固體即為Gly-TPP。

圖1 Gly-TPP的合成路線

稱取25 mg左右的Gly-TPP，溶解在600 μL D2O中，對其進行核磁共振氫譜（1H-NMR）表征，并計算TPP的取代度（degree of substitution，DS）。同時，采用紫外-可見分光光度計在200～800 nm對糖原、TPP、Gly-TPP進行全波長掃描，對樣品的紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）進行分析；利用全反射傅里葉紅外光譜儀在4000～500 cm?1記錄其FT-IR數據，并分析其特征官能團。此外，將Gly-TPP溶于蒸餾水中，分別置于比色皿和U形電位杯中，利用Zetasizer Nano ZS納米粒度儀測定納米粒的平均粒徑、多分散系數和ζ電位。

不同投料比（物質的量比）下所得Gly-TPP的表征結果如表1所示，隨著TPP投料的增加，TPP的取代度逐漸增加，正電性逐漸增強。與此同時，粒徑也在逐漸增大，投料比由1∶1增大到1∶2時，粒徑由（71.76±3.01）nm增加至（127.65±27.65）nm，均一度也下降。投料比為1∶2時，雖然納米粒具有最高的ζ電位，但是粒徑卻突增且均一性下降，表明糖原納米粒的樹枝狀結構可能發生了變化，內部結構變得松散，容易出現藥物泄露的情況，并且較大的粒徑可能導致粒子的聚集沉降，致使納米粒溶液的穩定性變差，不利于后續的應用。最終選用1∶1投料比下所獲得的Gly-TPP進行后續實驗，在此條件下，納米粒具有均一且較小的粒徑和較高的正電性。

表1 不同投料比下Gly-TPP的表征結果

Table 1 Characterization results of Gly-TPP at different feeding ratios

Gly-TPPDS/%粒徑/nmPDIζ電位/mV 4∶12.92±0.0468.10±0.920.27±0.01?0.91±0.05 2∶18.46±0.0575.63±1.730.41±0.024.81±0.51 1∶116.02±0.0771.76±3.010.27±0.0319.43±0.37 1∶221.81±0.19127.65±27.650.38±0.0923.43±3.59

圖2-a為糖原的1H-NMR，5.45（H1）處為糖原葡萄糖單元上C1位上氫的特征吸收峰，4.02～3.62（H2～H6）處為糖原葡萄糖單元上C2～C6位上氫的特征吸收峰。而在Gly-TPP的核磁圖譜（圖2-b）中，由于羰基對葡萄糖單元的影響，化學位移向高場偏移，H1的特殊吸收峰出現在5.33，H2～H6的特殊吸收峰出現在3.96～3.33。與此同時，7.94～7.51處出現TPP上苯基氫的特征吸收峰，2.37、1.69、1.24～1.19處出現TPP上亞甲基氫的特征吸收峰，由此說明TPP被成功修飾在糖原上。通過峰面積的積分計算糖原上TPP分子的取代度，即平均每個糖原葡萄糖單元所接枝TPP分子的個數，7.94～7.51為TPP分子中苯基中15個氫原子化學位移，5.33處為Gly-TPP葡萄糖單元1號碳上1個氫原子化學位移。

為了進一步驗證Gly-TPP的成功合成，接下來通過對其UV-Vis和FT-IR圖譜進行驗證分析。如圖3所示，糖原在波長200～800 nm沒有特征紫外吸收，而經TPP修飾后，在268 nm處出現了紫外吸收。在FT-IR圖譜（圖4）中，Gly-TPP在1 726.4 cm?1處出現了新的吸收峰，歸屬于糖原與TPP反應時新生成的酯鍵羰基伸縮振動，同時，1 438.1 cm?1處出現TPP分子上磷-苯伸縮振動產生的特征吸收峰。通過以上分析可以表明TPP被成功的修飾在糖原上。

圖2 糖原(a) 和Gly-TPP (b) 在重水中的核磁譜圖

由于糖原特殊的樹枝狀結構，糖原分子常常以納米級球體的形式存在，在對糖原進行修飾后，通過DLS測定Gly-TPP的粒徑和ζ電位。TPP修飾后，納米粒粒徑幾乎沒有改變，而ζ電位由（?5.42±0.32）mV變為（19.43±0.37）mV，這是TPP結構中磷鹽的影響。有研究表明，由于細胞膜呈負電性，正電性的納米粒往往具有更高的細胞攝取效率[19]，說明在藥物遞送領域，Gly-TPP具有繼續深入研究的必要性。

圖3 糖原、TPP和Gly-TPP的UV-Vis圖譜

圖4 糖原、TPP和Gly-TPP的FT-IR圖譜

2.2 Gly-TPP的細胞毒性考察

在以往的研究當中，聚合物的陽離子特性是其具有細胞毒性的決定因素之一，其所攜帶的正電荷會破壞細胞的膜結構，對細胞造成傷害[20]。因此，本實驗以NIH-3T3細胞為模型，采用MTT法評價Gly-TPP的細胞毒性，將細胞以7×103個/孔的密度鋪于96孔板中，在37 ℃、5% CO2環境中孵育12 h使其貼壁生長后，加入100 μL含不同濃度Gly-TPP的培養基孵育24 h后棄去培養基，每孔加入100 μL MTT溶液（0.5 mg/mL），孵育4 h后，棄去MTT溶液并加入DMSO（100 μL/孔）溶解藍紫色晶體，孵育15 min后，測定每孔在570 nm處的吸光度并計算細胞存活率，結果如表2所示。

TPP修飾的糖原納米粒，盡管表面呈現正電性，但是在質量濃度0～400 μg/mL與細胞共孵育后，細胞的存活率均高于95%，說明Gly-TPP對細胞基本無毒，是一種安全性良好的藥物遞送載體，與一般陽離子聚合物相比，在藥物遞送領域，特別是基因遞送方面，具有更明顯的優勢。這可能是因為糖原納米粒良好的生物可降解性，在進入細胞后，可以被細胞內環境中的酶降解，從而避免正電性帶來的毒性。

表2 Gly-TPP對NIH-3T3細胞的體外毒性評價

Table 2 In vitro cytotoxicity of Gly-TPP on NIH-3T3 cells

質量濃度/(μg?mL?1)細胞存活率/%質量濃度/(μg?mL?1)細胞存活率/% 0100.00±1.1150106.37±0.52 1100.98±1.55100102.96±3.74 5103.52±1.68200107.35±2.63 1098.90±1.99300105.65±4.21 20107.36±2.15400107.35±8.67

2.3 BA/Gly-TPP的制備與表征

采用透析法制備包載黃芩苷的納米粒。首先，將Gly-TPP溶于蒸餾水中，黃芩苷溶于DMF中。將有機相逐滴滴加入水相中，攪拌一定時間，將混合溶液置于透析袋中，在攪拌的1 L蒸餾水中透析8 h，期間更換一次透析液，以完全除去DMF，收集透析袋中的溶液，過0.22 μm的微孔濾膜除去未包載的黃芩苷，即得載藥納米粒溶液（BA/Gly-TPP NPs）。使用DLS測定其平均粒徑、多分散系數和ζ電位。同時，對納米粒的形態進行觀察，將Gly-TPP稀釋至合適質量濃度，將溶液滴在鍍碳膜的銅網上，待液滴自然揮發干后利用TEM進行觀察。

結果（圖5-a）顯示，Gly-TPP NPs水化半徑為（71.76±3.01）nm，ζ電位為（19.43±0.37）mV，在包載藥物后，粒徑略有增大，變為（86.15±7.14）nm，而ζ電位降為（8.84±0.89）mV，這可能是因為黃芩苷結構中的羥基影響了納米粒的電位。載藥納米粒BA/Gly-TPP NPs粒徑分布圖和Gly-TPP NPs的TEM形貌見圖5-b，可以看到Gly-TPP NPs呈均勻的球形，且粒徑較為均一。

2.4 包封率和載藥量的測定

首先，通過紫外吸收值與質量濃度的關系建立黃芩苷的標準曲線。取黃芩苷適量用DMF溶解，以DMF為對照，用紫外-可見分光光度計在波長200～800 nm進行全波長掃描，確定黃芩苷的最大吸收波長。同時，用同樣的方法在200～800 nm掃描Gly-TPP在水溶液中的紫外-可見吸收光譜。稱取黃芩苷對照品5.0 mg于10 mL量瓶，用DMF定容。得到黃芩苷質量濃度為0.5 mg/mL的黃芩苷儲備液。分別吸取儲備液0.5、5、10、50、100、200 μL置于5 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，充分搖勻，即得質量濃度為0.05、0.5、1、5、10、20 μg/mL的黃芩苷對照品溶液。以DMF為對照溶液，在紫外最大吸收波長處測定其吸光度（）值，以質量濃度為橫坐標，值為縱坐標建立坐標系，利用回歸分析的方法繪制黃芩苷在DMF中的標準曲線。

圖5 BA/Gly-TPP的粒徑分布 (a) 和Gly-TPP的TEM形貌(b)

由圖6可知，黃芩苷有2個紫外特征吸收峰，但是在275 nm處，載體Gly-TPP也有紫外吸收，會對黃芩苷的定量測定造成干擾，于是選擇316 nm處作為測定黃芩苷含量的波長。最終得黃芩苷在316 nm處的標準曲線，回歸方程為＝0.032 3＋0.005 3，2＝0.999 0，說明在0.05～20 μg/mL，黃芩苷的值與質量濃度之間具有良好的線性關系。

測定載藥納米粒的包封率和載藥量時，用過量DMF稀釋BA/Gly-TPP NPs溶液，超聲10 min，將黃芩苷充分的釋出。按照上述紫外吸收光譜條件進行檢測，利用上述標準曲線計算出被包載的藥物總量，記為b，假設理論投藥量為t，被包載藥物總量和載體總質量為o，則可按公式計算得包封率和載藥量。

包封率＝b/t

圖6 黃芩苷和Gly-TPP的紫外-可見吸收光譜

載藥量＝b/o

最終得Gly-TPP納米粒包載黃芩苷的載藥量為（20.67±0.16）%，包封率為（62.04±0.48）%，說明Gly-TPP能夠高效的包載小分子藥物黃芩苷，但是包封率略低，推測是因為在流動的水溶液中制備載藥納米粒，部分黃芩苷溶于水中造成損失。這也提示在后續研究中需進一步篩選不同比例和實驗條件，或者對糖原納米粒表面進行修飾，以優化增加包封率。

2.5 BA/Gly-TPP NPs的粒徑穩定性研究

將新鮮制備的BA/Gly-TPP NPs溶液置于4 ℃環境下，連續7 d監測其粒徑大小，考察其儲存穩定性。如表3所示，7 d內，新鮮制備的BA/Gly-TPP NPs粒徑沒有明顯變化，直接觀察無明顯沉淀和絮凝，表明在當前條件下BA/Gly-TPP在7 d內能夠保持穩定。

表3 BA/Gly-TPP在4℃環境下的粒徑

Table 3 Particle size change of BA/Gly-TPP at 4 ℃

t/d粒徑/nmt/d粒徑/nm 175.40±1.16575.08±3.06 275.18±1.24671.76±3.67 377.72±2.56778.61±4.31 476.46±2.87

2.6 BA/Gly-TPP的體外釋放行為研究

采用透析法考察載藥納米粒的體外釋放行為，以黃芩苷單體作為對照，選擇pH 7.4和4.5的PBS作為釋放介質。將樣品裝入透析袋，兩頭扎緊，完全浸沒于20 mL PBS中。實驗在37 ℃、100 r/min的搖床中進行，在0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取出1 mL釋放介質并補充相同體積的新鮮釋放介質。使用紫外分光光度計測定不同時間點所取PBS在316 nm處的值，代入標準曲線方程，計算出黃芩苷的含量，從而得出藥物的累積釋放量（）。

黃芩苷為載藥納米粒中黃芩苷的含量，0為釋放介質的總體積，e為每次取出的釋放介質體積，C為第個樣品的藥物質量濃度

結果如圖7所示，在pH 4.5的PBS中，藥物迅速釋放，1 h時2組均釋放完全。而在pH 7.4的PBS中，初期2組藥物釋放行為相似，1 h的累積釋放率分別為（61.29±2.43）%和（58.24±2.91）%，這可能是因為部分藥物包載不夠深入，或者僅僅是吸附在納米粒的外層。隨后，藥物進入較為緩慢的持續釋放模式，最終24 h的累積釋放量分別為（83.76±3.92）%和（75.76±2.23）%，與游離黃芩苷相比，BA/Gly-TPP NPs具有一定的緩釋效果。前期較快的釋放能夠保證藥物在病灶部位迅速的達到有效治療質量濃度，但是也在一定程度上造成了藥物的浪費，這也提示后續需要對糖原納米粒進行更精密的功能化修飾，例如，表面修飾聚合物延緩藥物釋放，或引入能夠響應病灶部位特殊生理環境的結構，以控制藥物的釋放。

納米粒中藥物釋放除了與藥物和載體的性質有關還與藥物在納米顆粒中所處的位置有關。藥物既有完全包裹進粒子內部的，也有附著在粒子表面的，不同位置的藥物釋放速率不同。粒子表面的藥物釋放量與時間變化成正比、釋放量隨時間增加呈遞減關系，淺表孔隙和深層空腔中藥物釋放受擴散控制。因此，本實驗通過數學模型對分別應用零級動力學模型，一級動力學模型、Niebergull模型、Higuchi模型對BA/Gly-TPP NPs在pH 7.4條件下的體外釋放數據進行擬合，考察其體外釋放性能。結果見表4，從擬合相關系數可知，BA/Gly-TPP NPs的體外釋放與一級動力學模型擬合最好，此時藥物以非恒速釋放，粒子中剩余藥物量的對數與時間成正比。

圖7 游離黃芩苷和BA/Gly-TPP NPs在pH 7.4、4.5 PBS中的體外釋藥行為

表4 BA/Gly-TPP NPs的體外釋藥數據模型擬合

Table 4 Invitro release data model fitting of BA/Gly-TPP NPs

擬合模型方程R2 零級動力學Q＝1.879 t＋46.1270.229 一級動力學Q＝10.062 lnt＋52.4190.797 NiebergullQ＝?0.234 5 t2＋7.208 8 t＋35.160.580 HiguchiQ＝12.672 t1/2＋32.570.530

3 討論

糖原由于其良好的生物相容性和生物可降解性等特性，已廣泛應用于藥物遞送領域，但是僅憑借其固有的特性往往不能很好地適應復雜多變的病理情況。本實驗合成線粒體靶向糖原衍生物，通過核磁共振、紅外吸收、紫外吸收特征對其進行結構驗證，同時，以NIH-3T3細胞為實驗模型，考察其細胞毒性。實驗結果顯示，Gly-TPP能夠有效改善疏水藥物黃芩苷的溶解性，裝載藥物的能力良好。

目前，黃芩苷在臨床應用中是以片劑、膠囊劑等固體制劑為主，口服吸收率低，而BA/Gly-TPP NPs的出現給黃芩苷以液體形式給藥提供了新的思路，若以口服液的形式給藥，Gly-TPP的正電荷性質能夠幫助藥物快速跨過胃腸膜，被靶細胞攝取，同時黃芩苷前期釋放速度快，能夠迅速達到有效治療濃度。面對復雜的病理環境，希望藥物遞送系統能夠更加智能，而Gly-TPP不僅能夠與負電性的透明質酸、聚乙二醇等生物相容性良好的物質通過靜電相互作用，構建具有核殼結構的納米粒，延長藥物在體內的循環時間；同時還含有大量活性基團，能夠通過化學修飾引入靶向病灶部位、增加膜通透性或具有刺激響應能力的結構，從而實現主動靶向、高效率攝取、響應釋放等功能，相信隨著研究的深入，Gly-TPP將在藥物遞送領域扮演越來越重要的角色。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and characterization of baicalin-loaded mitochondria-targeted glycogen nanoparticles

XU Jia-min, WANG Jun-ze, ZHAO Bing-ke, LI Wen-hua, CHEN Jing-hua, QIU Li-peng

School of Life Sciences and Health Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

To synthesize (4-carboxybutyl) triphenylphosphonium bromide (TPP) modified glycogen (Gly), prepare baicalin (BA) loaded glycogen nanoparticles (BA/Gly-TPP NPs), and investigate the physicochemical properties of the nanoparticles.TPP was linked to Gly through an esterification reaction to synthesize mitochondrial targeting dendritic macromolecular nanoparticles Gly-TPP NPs. The structure was determined by1H-NMR, UV and IR spectra, and the safety was tested by cytotoxicity test. Then, BA was encapsulated into Gly-TPP to construct a drug delivery system BA/Gly-TPP NPs. Particle size, drug loading,release and particle size stability of the nanoparticles were investigated.Gly-TPP was successfully synthesized and showed regular sphericity and no cytotoxic. BA/Gly-TPP NPs had regular spherical shape with mean particle size of about 70—80 nm, ζ potential of (8.84 ± 0.89) mV, drug loading of (20.67 ± 0.16)%, and a good drug release behavior.Gly-TPP shows good performance for drug delivery, which will provide a new choice for the design of nanocarrier delivery system.

glycogen; triphenylphosphine; baicalin; mitochondrial targeting; drug delivery

R283.6

A

0253 - 2670(2022)17 - 5305 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.006

2022-03-20

國家重點研發計劃項目（2021YFC2103100）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK20201344）

許嘉敏，碩士研究生，研究方向為藥物遞送系統。

邱立朋，男，副教授，碩士生導師，研究方向為納米藥物遞送系統。Tel: (0510)85329042 E-mail: qiulp@jiangnan.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]