鉤枝藤總生物堿對非小細胞肺癌細胞系表達譜及免疫微環(huán)境的影響

李中玉，趙一燃，門 磊，弓曉杰，李珂珂

鉤枝藤總生物堿對非小細胞肺癌細胞系表達譜及免疫微環(huán)境的影響

李中玉1, 2, 3，趙一燃1, 2, 3，門 磊1, 2, 3，弓曉杰1, 2, 3，李珂珂1, 2, 3*

1. 大連民族大學生命科學學院，遼寧 大連 116600 2. 生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600 3. 遼寧省民族藥功效成分開發(fā)與應用重點實驗室，遼寧 大連 116600

研究鉤枝藤總生物堿對非小細胞肺癌細胞系表達譜的影響，篩選出差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）并對功能基因進行分析和挖掘，以期為鉤枝藤抗肺癌的分子機制提供理論依據(jù)。將非小細胞肺癌NCI-H1975細胞分為對照組和鉤枝藤總生物堿處理組，使用RNA-Seq技術開展全轉錄組測序，獲取DEGs；對DEGs進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；篩選差異基因核心模塊并分析其影響功能，進一步分析關鍵基因對非小細胞肺癌生存期的影響；通過分析鉤枝藤總生物堿對非小細胞肺癌免疫細胞腫瘤浸潤的情況，確定關鍵基因表達與免疫浸潤水平的相關性。對照組和藥物組共檢測到2976個DEGs，其中藥物組664個DEGs上調，2312個DEGs下調。鉤枝藤總生物堿對鐵死亡、氧化磷酸化、線粒體、溶酶體、細胞間隙連接、核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide binding oligomerization domain，NOD）樣受體等介導的信號通路產生重要影響。在DEGs核心模塊中，白細胞介素11（interleukin 11，）的高表達可顯著影響非小細胞肺癌患者的生存期，是非小細胞肺癌患者不良預后的關鍵因素之一；角形四肽重復干擾素誘導蛋白3（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 3，）、白細胞介素7受體（interleukin 7 receptor，）、2′,5′-寡腺苷酸合成酶2（2′,5′-oligoadenylate synthetase 2，）、-腺苷甲硫氨酸基結構域蛋白2（radical-adenosyl methionine domain containing 2，）、受體轉運蛋白4（receptor transporter protein 4，）、不育α基序結構域9樣（sterile alpha motif domain containing 9-like gene，）、X染色體連鎖凋亡抑制蛋白相關因子1（X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1，）的表達水平影響了非小細胞肺癌組織的純度和免疫細胞浸潤的類型，可能改變非小細胞肺癌的免疫微環(huán)境。鉤枝藤總生物堿能夠影響非小細胞肺癌細胞的轉錄譜，具有潛在的抗非小細胞肺癌活性作用。

鉤枝藤；非小細胞肺癌；生物堿；轉錄組測序；免疫浸潤

癌癥已成為全球范圍內主要的公共衛(wèi)生問題，據(jù)預測，未來20年內全球癌癥負擔將繼續(xù)增加[1]。我國肺癌的發(fā)病率與死亡率均居前列[2-3]，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌病例的85%[4]。化療藥在NSCLC的治療中發(fā)揮了重要作用，但由于耐藥及不良反應等問題，依然沒有取得令人滿意的治療效果[5]。化療藥作為治療NSCLC的有效手段，醫(yī)療需求巨大，國內外藥物學家研制新型抗NSCLC藥物的潮流方興未艾，是NSCLC治療領域的研究熱點和重要發(fā)展方向。

鉤枝藤屬植物在全世界共有約20種，我國僅分布1種，即鉤枝藤(Lour.) Merr.，生長于海南島。鉤枝藤在我國的藥用歷史悠久，是海南黎族人民的常用藥物之一[6]。據(jù)《黎族藥志》記載，鉤枝藤具有軟堅散結、消炎、止瀉、行氣等功效，民間常用于治療瘧疾、寄生蟲感染等疾病[7]。現(xiàn)代藥理學研究表明，鉤枝藤具有抗腫瘤活性。早在1981年，我國學者已研究發(fā)現(xiàn)，鉤枝藤總生物堿對大鼠W256肉瘤、小鼠S180肉瘤和艾氏腹水瘤有抑制作用[8]，并且其生物堿類單體化合物對人胃癌SGC-7721細胞、人肝癌BEL-7402細胞及人白血病K562細胞具有生長抑制活性[9-10]。近年來，Bringmann等[11-12]、Seupel等[13]研究顯示，鉤枝藤中的生物堿類化合物對人急性淋巴白血病CCRF-CEM細胞及其耐藥細胞CEM/ADR5000具有較強的細胞毒活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鉤枝藤提取物在體外對人白血病HL-60細胞、人非小細胞肺癌A549細胞、人肝癌SMMC-7721細胞、人乳腺癌MCF-7細胞和人結腸癌SW480細胞均具有較強的抑制活性，特別是可以選擇性地抑制肺癌細胞增殖，對NSCLC細胞NCI-H1975的敏感性最強[14]。以上研究表明鉤枝藤具有一定的抗癌活性，在作為抗腫瘤或輔助治療藥物方面具有較大潛力。本研究通過全轉錄組測序技術，系統(tǒng)研究鉤枝藤總生物堿對NSCLC細胞表達譜的影響，旨在全面分析鉤枝藤總生物堿對NSCLC細胞關鍵生物學功能及免疫微環(huán)境產生的潛在影響，為進一步揭示鉤枝藤總生物堿抗NSCLC的可能機制提供新的切入點，也為鉤枝藤應用于NSCLC治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞

人非小細胞肺癌NCI-H1975細胞購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司。

1.2 藥材

鉤枝藤采自海南省樂東縣，經(jīng)大連民族大學弓曉杰教授鑒定為鉤枝藤科鉤枝藤屬植物鉤枝藤(Lour.) Merr.的枝葉。

1.3 藥品與試劑

胎牛血清（批號10270106）、RPMI 1640完全培養(yǎng)基（批號12633012）購自美國Gibco公司；Trizol試劑（批號10296010）購自美國Invitrogen公司；Qubit RNA試劑（批號Q32852）購自美國Life Technologies公司；NEBNext Ultra RNA庫制備試劑盒（批號E7765S）購自美國New England Biolabs公司。

1.4 儀器

N1001型旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；Alpha 1-4 LDplus型冷凍干燥機（德國Martin Christ公司）；Steri-Cycle型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Qubit?3.0型Qubit熒光定量儀（美國Life Technologies公司）；Novaseq 6000型測序儀（美國Illumina公司）。

2 方法

2.1 鉤枝藤總生物堿的制備

取新鮮干燥的鉤枝藤枝葉，用95%乙醇回流提取，濃縮所得浸膏用2%鹽酸溶解，濾過，將濾液用環(huán)己烷萃取后分得酸水層藥液，在酸水層中加入二氯甲烷萃取，氨水調pH至10，分離得到二氯甲烷層藥液，將其減壓濃縮至膏狀，再冷凍干燥，得到棕黃色粉末，即為鉤枝藤總生物堿。采用酸性染料比色法，以溴甲酚綠為酸性染料，通過測定條件優(yōu)化及方法學考察，計算得到鉤枝藤總生物堿中生物堿的質量分數(shù)為52.6%。

2.2 細胞培養(yǎng)

NCI-H1975細胞復蘇后，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天更換新鮮培養(yǎng)基，2～3 d傳代1次。傳代時PBS潤洗，胰酶消化，用完全培養(yǎng)基終止消化，制成細胞懸液，計數(shù)后接種培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的NCI-H1975細胞用于后續(xù)實驗。

2.3 藥物處理

根據(jù)本課題組前期預實驗，確定以接近鉤枝藤總生物堿對NCI-H1975細胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentratin，IC50）＝77.2 μg/mL為給藥質量濃度。將NCI-H1975細胞接種于6孔板中，每孔2×105個，培養(yǎng)12 h。取鉤枝藤總生物堿，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基溶解使其終質量濃度為80 μg/mL，將含藥培養(yǎng)基加入給藥組細胞中，對照組加入等量不含藥培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集用于下一步實驗。

2.4 轉錄組測序

加入TRI試劑提取細胞總RNA，使用Qubit熒光定量儀測定RNA純度和濃度，通過電泳跑膠確定樣本總量和質量滿足建庫要求。進行RNA測序文庫構建，通過PCR富集得到cDNA文庫。為了提高測序準確性，減少測序過程中的風險，測序前用定量PCR進行文庫質檢，測定文庫樣品的濃度和片段大小分布，檢測文庫質量滿足要求，確定合適的上機混合測序方案。文庫質檢要求為主峰300～600 bp，有效濃度≥10 nmol/L。使用Illumina Novaseq 6000型測序儀進行上機測序。Illumina文庫上機測序前進行橋式PCR擴增反應，文庫測序時的狀態(tài)其實是擴增后的狀態(tài)，而以Illumina文庫兩側接頭引物做qPCR，其擴增后的產物狀態(tài)和文庫測序時的狀態(tài)是最接近的。

2.5 差異基因的篩選

將測序得到的轉錄組原始數(shù)據(jù)進行預處理，得到干凈序列，使用短序列比對軟件進行序列比對，利用比對結果文件進行轉錄本構建，通過Cufflinks程序計算各個基因的表達量用于后續(xù)分析。通過DESeq2算法進行差異表達基因（differential expression genes，DEGs）的篩選分析，篩選條件為|log2(fold change)|＞2和校正后＜0.05；使用R包“ggplot2”繪制聚類圖和火山圖。

2.6 基因本體（gene ontology，GO）功能與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

基于基因注釋數(shù)據(jù)庫，檢測差異基因顯著通路。使用R包“clusterProfiler”和“enrichplot”進行DEGs的GO功能及KEGG通路富集分析，＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.7 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建與分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org）構建網(wǎng)絡，通過Cytoscape程序開展進一步分析。選擇包含做多節(jié)點數(shù)的基因集，對模塊進行排序，確定排序最前為關鍵模塊，進一步對關鍵模塊中基因進行KEGG通路與GO功能富集分析。PPI分析時，置信度為0.4，隱藏所有孤立的蛋白，無限制詞，使用MCODE插件確定PPI網(wǎng)絡中的核心模塊（degree cutoff＝2，node score cutoff＝0.2，-core＝2，max.depth＝100），前3個模塊得分分別為9.727、7.429、5。

2.8 關鍵DEGs的預后分析

通過TCGA數(shù)據(jù)庫的測序數(shù)據(jù)對人群中DEGs的情況進行分析，使用GEPIA中的預后分析模塊驗證非小細胞肺癌預后與關鍵基因表達的相關性，評估關鍵基因對預后的影響，＜0.05認為差異存在統(tǒng)計學意義。

2.9 關鍵DEGs影響免疫細胞浸潤的分析

使用TIMER數(shù)據(jù)庫進行Spearman相關性計算，分析與預后相關的DEGs與免疫細胞（B細胞、中性粒細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞）浸潤之間的相關性；相關條件為相關系數(shù)絕對值≥0.3，＋/?分別表示正/負相關性，＜0.05認為差異存在統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 NCI-H1975細胞表達譜分析

對實驗數(shù)據(jù)進行篩選濾過處理，除去低質量的測序結果，共得到30 031個基因。首先利用檢驗，分析得到各個值以及倍數(shù)變化（fold change）值，對倍數(shù)變化值進行l(wèi)og2轉化，然后將值進行?lg轉化。由于值越小越顯著，所以進行?lg的轉化后，轉化值越大其差異就越顯著。以必須滿足|log2(fold change)|＞2和校正后＜0.05，即當以上2種條件同時符合的情況交集出的基因群為顯著性高并且穩(wěn)定的DEGs。通過表達量差異分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)鉤枝藤總生物堿處理后轉錄組表達水平有明顯差異，火山圖直接反映DEGs分布情況，藍色為下調，紅色為上調（圖1-A）。統(tǒng)計約10%的基因表達發(fā)生了改變，共計2976個DEGs。DEGs中表達下調基因明顯多于表達上調基因，其中2312個下調，664個上調。

為反映藥物影響的DEGs情況，對不同表達模式的基因通過基因表達聚類熱圖顯示（圖1-B）。結果顯示，給藥組NCI-H1975細胞表達譜與對照組差異明顯，并能夠聚類，顯示2組表達譜具有異質性，直觀可見給予鉤枝藤總生物堿后影響細胞內基因的差異變化情況。表明鉤枝藤總生物堿對NCI-H1975細胞的表達譜有顯著影響。

A-DEGs火山圖 B-DEGs熱圖

3.2 DEGs功能分析

差異基因功能富集分析是通過不同的數(shù)據(jù)庫對基因功能進行歸類，對差異基因的生物途徑進行注釋及分類并進行統(tǒng)計學分析，以進一步尋找藥物的主要作用靶點。通過GO功能分析，確定DEGs在細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）3個層面上的影響。分別將所有上調及下調的DEGs作為前景基因，進行差異基因分析的所有基因為背景基因，進行GO功能富集。GO功能富集結果＜0.05，被定義為差異基因在給定基因集中顯著富集的GO條目和通路。在此分析中，對值取負對數(shù)（?lg），值越小，?lg越大，富集程度越大，該GO條目越有意義，進一步按照值進行排序，表達上調組和下調組各取前10進行展示（圖2）。結果顯示，在MF層面表達上調的DEGs影響了核糖結合、RNA催化活性、連接酶活性等；表達下調的DEGs影響了微管運動、細胞黏附分子結合、肌動蛋白結合、鈣黏蛋白結合等。在CC層面表達上調的DEGs影響了核糖體與線粒體等，表達下調的DEGs影響了肌動蛋白細胞骨架、溶酶體、收縮纖維、細胞-細胞黏附連接、胞質區(qū)等。在BP層面表達上調的DEGs影響了細胞對核糖體生物合成、rRNA加工與代謝的作用等；表達下調的DEGs影響了細胞骨架組織的調控、細胞連接、整合素及干擾素介導的信號傳導等。這些表達水平改變最顯著的相關基因，與影響NSCLC細胞的增殖、凋亡和侵襲轉移高度相關。

A-上調DEGs的GO功能富集分析 B-下調DEGs的GO功能富集分析

3.3 DEGs信號通路分析

KEGG通路富集分析是東京大學和京都大學共同研制的數(shù)據(jù)庫，可查詢通路，進一步尋找活性成分作用靶點顯著富集的體內通路[15]。體內不同基因通過相互作用行使復雜的生物學功能，進行信號通路分析可確定DEGs參與的主要信號轉導和生化代謝途徑。分別將所有上調及下調的DEGs作為前景基因，進行差異基因分析的所有基因為背景基因，分別對DEGs表達上調組和表達下調組進行KEGG通路分析（圖3），通路富集＜0.05。結果顯示，表達上調的DEGs主要影響了鐵死亡、氧化磷酸化、線粒體自噬、錯配修復、RNA轉運與降解、聚糖降解等途徑；表達下調的DEGs主要影響了病毒致癌、蛋白聚糖、溶酶體、細胞間隙連接、NOD樣受體介導的信號通路等。

以上結果表明，使用鉤枝藤總生物堿處理NCI-H1975細胞后，與細胞的增殖、凋亡和侵襲密切相關的鐵死亡、氧化磷酸化、線粒體自噬、溶酶體、細胞間隙連接、NOD樣受體介導的信號通路等受到顯著影響。提示鉤枝藤總生物堿可能通過作用于這些通路影響了NCI-H1975細胞的增殖和凋亡，并有潛力抑制腫瘤侵襲轉移。

A-上調DEGs的KEGG通路分析 B-下調DEGs的KEGG通路分析

3.4 PPI網(wǎng)絡和關鍵模塊分析

PPI網(wǎng)絡是從生物化學、信號轉導和遺傳網(wǎng)絡的角度來可視化構建藥物和疾病相關蛋白分子之間的相關性，能更好地理解基因編碼的蛋白直接或間接的參與細胞的生物學功能。設置節(jié)點的大小代表度值（degree），節(jié)點越大，表示其度值越大，最終獲得PPI網(wǎng)絡圖。DEGs的PPI網(wǎng)絡通過STRING數(shù)據(jù)庫構建并進行分析，通過MCODE確定PPI網(wǎng)絡中的前3個模塊（圖4），將排序第1的模塊為核心模塊。核心模塊1包含23個節(jié)點和107條邊，所含基因包括白細胞介素11（interleukin 11，）、2′,5′-寡腺苷酸合成酶2（2′,5′-oligoadenylate synthetase 2，）、白細胞介素7受體（interleukin 7 receptor，）、骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物（myelocytomatosis viral oncogene homolog，）、X染色體連鎖凋亡抑制蛋白相關因子1（X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1，）、腫瘤壞死因子超家族成員10（tumor necrosis factor superfamily 10，）、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，）、無翅型MMTV整合位點家族3A（wingless-type MMTV integration site family, member 3A，）、細胞因子受體樣因子2（cytokine receptor-like factor 2，）、激酶插入域受體（kinase insert domain receptor，）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，）、SRY相關高遷移率族盒蛋白轉錄因子2（sry-related high-mobility-group box-containing 2，）、受體轉運蛋白4（receptor transporter protein 4，）、角形四肽重復干擾素誘導蛋白3（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 3，）、成纖維細胞生長因子8（fibroblast growth factor 8，）、不育α基序結構域9樣（sterile alpha motif domain containing 9-like gene，）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，）、表皮生長因子（epidermal growth factor，）、、、促紅細胞生成素（erythropoietin，）、、等。

通過對核心模塊中基因進行分析，包括KEGG通路和GO功能富集分析，顯示核心模塊1中基因可影響細胞因子受體相互作用、Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導和激活轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）及叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，F(xiàn)OXO）相關信號通路（圖5-A），同時還可影響I型干擾素信號通路及STAT受體信號通路等的調節(jié)功能（圖5-B）。

圖4 PPI網(wǎng)絡分析

圖5 核心模塊基因的KEGG通路(A) 和GO功能(B) 富集分析

3.5 關鍵基因對NSCLC預后和免疫細胞浸潤的影響

腫瘤浸潤是指腫瘤細胞分裂增生進入到周圍的組織間隙、淋巴瘤血管內，并破壞周圍的組織，對NSCLC治療和患者預后有重要影響。首先研究核心模塊中關鍵基因對NSCLC預后的影響，發(fā)現(xiàn)基因在NSCLC中的表達水平明顯高于肺正常組織的表達水平，且基因的高表達與NSCLC不良預后相關（圖6）。進一步通過TIMER 2.0分析6種免疫細胞浸潤的情況，以確定相關基因表達與免疫細胞浸潤之間的相關性。如表1所示，與中性粒細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞浸潤水平呈正相關；與中性粒細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞浸潤水平呈正相關；與NSCLC細胞純度呈負相關，與6種免疫細胞浸潤水平均呈正相關；與中性粒細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞浸潤水平呈正相關；與中性粒細胞、樹突狀細胞浸潤水平呈正相關；與CD4+T細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞浸潤水平呈正相關；與NSCLC細胞純度呈負相關，與B細胞、中性粒細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞浸潤水平呈正相關；與NSCLC細胞純度呈負相關，與中性粒細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞浸潤水平呈正相關。

A-IL11基因在NSCLC癌組織中的表達情況箱線圖 B-IL11基因表達對NSCLC預后的影響 ***P＜0.001

表1 關鍵基因與免疫細胞浸潤之間的相關性分析

Table 1 Analysis of correlation between key genes and immune infiltration

基因NSCLC細胞純度B細胞CD8+ T細胞CD4+ T細胞 相關系數(shù)P值相關系數(shù)P值相關系數(shù)P值相關系數(shù)P值 IFIT2?0.2541.00×10?80.1471.22×10?30.2915.44×10?110.3335.05×10?14 IFIT3?0.2841.29×10?100.0983.18×10?20.3242.11×10?130.2658.37×10?9 IL7R?0.4621.96×10?270.3741.65×10?170.5282.29×10?360.4095.64×10?21 OAS2?0.2878.26×10?110.1062.01×10?20.2511.84×10?80.3363.19×10?14 RSAD2?0.2737.08×10?100.0973.37×10?20.2026.68×10?60.2822.63×10?10 RTP4?0.2869.14×10?110.2757.34×10?100.2624.08×10?90.3787.50×10?18 SAMD9L?0.3965.49×10?200.3161.11×10?120.8658.82×10?170.5031.91×10?32 XAF1?0.3664.23×10?170.2822.63×10?100.1816.11×10?50.5404.68×10?38 基因巨噬細胞中性粒細胞樹突狀細胞 相關系數(shù)P值相關系數(shù)P值相關系數(shù)P值 IFIT20.3112.64×10?120.4971.62×10?310.5498.66×10?40 IFIT30.2322.48×10?70.4999.40×10?320.5031.18×10?52 IL7R0.4839.24×10?300.6585.49×10?610.6466.87×10?59 OAS20.2064.65×10?60.4591.44×10?260.4364.42×10?24 RSAD20.2246.59×10?70.4341.25×10?230.4481.65×10?25 RTP40.0943.90×10?20.4178.72×10?220.4348.48×10?24 SAMD9L0.2701.61×10?90.6224.29×10?580.6221.54×10?53 XAF10.1323.68×10?30.4431.40×10?240.4311.53×10?23

4 討論

目前，治療NSCLC藥物的機制研究大部分僅針對少數(shù)幾個基因、蛋白的比較分析，對免疫微環(huán)境影響的探索也比較局限，一般僅在通路水平上進行探討，因此提供的信息較為單一，難以系統(tǒng)全面地認識相關基因的表達狀況[16]。大量的研究表明，基因和蛋白質較少單獨起作用，它們往往通過復雜的網(wǎng)絡交互作用共同影響生物系統(tǒng)的功能，這些功能高度相關的基因構成基因群[17]。轉錄組研究能夠全面地反映基因表達譜，從基因功能以及基因結構的整體水平揭示體內生物學的特定過程與疾病發(fā)生發(fā)展過程中的可能分子機制[18]。研究藥物對特定細胞系表達譜的影響可以為藥物開發(fā)提供更為詳實的理論依據(jù)[19]。鉤枝藤具有潛在的抗腫瘤活性，具有開發(fā)成NSCLC治療藥物的潛力，但其分子機制尚不明確。本研究采用二代測序技術，深入挖掘分析了鉤枝藤總生物堿處理NSCLC細胞系的轉錄組學數(shù)據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，鉤枝藤總生物堿能夠改變NCI-H1975細胞的表達譜，其中2312個基因下調，664個基因上調。通過轉錄組數(shù)據(jù)分析基因表達水平的變化，反映表型的差異。對于表達量高且差異很大的基因，或者共有的差異基因，都將是后續(xù)研究中重點關注的對象。進一步通過KEGG通路和GO功能富集分析，確定這些DEGs影響了鐵死亡、氧化磷酸化、線粒體自噬、錯配修復、RNA轉運與降解、聚糖降解、病毒致癌、蛋白聚糖、溶酶體、細胞間隙連接、NOD樣受體介導的信號通路等，表明鉤枝藤總生物堿可能影響NCI-H1975細胞的增殖、凋亡和侵襲。已有研究證實鉤枝藤對胃癌細胞、肝癌細胞及白血病細胞均具有一定的抑制增殖及促進凋亡作用[9-10]。這些差異基因顯著富集的通路，是反映藥物發(fā)揮重要作用的關鍵通路，目前這些基因與鉤枝藤在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的相互關系鮮有相關研究報道，可以在后續(xù)實驗研究中直接對這些通路展開分析和討論。

本研究通過PPI網(wǎng)絡構建和分析，發(fā)現(xiàn)核心模塊中關鍵基因的高表達是NSCLC預后不良因素，這與前期研究相符[20-21]，說明鉤枝藤總生物堿具有改善NSCLC預后的潛力。可介導纖維炎癥性疾病[22]，突變導致的信號丟失可預防肺纖維化，這與肌成纖維細胞中自分泌的活性降低有關[23-26]，提示能夠作為肺纖維化治療的潛在靶標。還能對子宮內膜癌細胞的黏附和遷移產生重要影響[27]，并能促進結腸炎進一步發(fā)展為結腸癌[28]。的高表達也有利于增強STAT3，促進胃癌的發(fā)展[29]。也有研究證實，/和上皮間質轉化/E盒結合鋅指蛋白1的信號協(xié)同通過S100蛋白表達的差異調節(jié)，驅動胰腺癌細胞的侵襲[30]。當前在NSCLC中研究尚較少，有深入探索的價值。

對核心模塊關鍵基因進行KEGG通路和GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)JAK/STAT、I型干擾素、FOXO等相關信號通路受到了影響。JAK/STAT通路是胞外細胞因子啟動受體介導的信號轉導核心，誘導癌癥和炎癥中關鍵介質的表達，參與細胞的分化、增殖、凋亡及炎癥等多個生理過程[31]；I型干擾素通過多種信號通路抑制細胞增殖、誘導分化、調節(jié)免疫系統(tǒng)和抑制血管生成，可以在肺癌治療中調節(jié)腫瘤細胞的生長活力及轉移性侵襲[32-33]；FOXO轉錄因子參與多種信號轉導，影響細胞的增殖、凋亡等過程，可作為治療癌癥藥物的靶點[34]。本研究發(fā)現(xiàn)其核心調控網(wǎng)絡主要參與細胞的凋亡、炎癥和免疫信號通路，處于PPI網(wǎng)絡中的等關鍵基因可能是其重要的藥效靶點。這從一定程度上說明鉤枝藤總生物堿抗NSCLC的機制可能與這些通路密切相關，提示鉤枝藤總生物堿可能通過參與多條信號通路來調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，后續(xù)將完善實驗，并針對這些基因進行表達水平分析和功能分析，為發(fā)現(xiàn)新的NSCLC治療靶點提供理論基礎。

腫瘤組織不只包含腫瘤細胞，還含有基質細胞、成纖維細胞、免疫細胞等其他不同類型的細胞，這些細胞整體構成了腫瘤的微環(huán)境。不同的免疫細胞在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮不同的作用，而不同腫瘤的免疫細胞組成也各有特點，所以分析藥物對免疫細胞浸潤的影響，對于研究藥物的腫瘤治療作用具有重要的指導意義。本研究發(fā)現(xiàn)核心模塊1中的、、、、、、、對NSCLC腫瘤組織腫瘤純度和浸潤免疫細胞類型均有影響。CD4+T細胞在腫瘤免疫響應和腫瘤治療中可以發(fā)揮多方面的作用，在腫瘤免疫治療領域得到了充分認可，可以用來控制腫瘤進展和預防患者復發(fā)[35]。中性粒細胞可以參與協(xié)調先天性和適應性免疫反應，介導促腫瘤和抗腫瘤反應，在癌癥生物學及癌癥預后中具有重要意義[36]。樹突狀細胞用于攝取腫瘤抗原和啟動不同亞群的抗原特異性T細胞，能夠啟動從頭的抗腫瘤反應[37]。這些結果表明，鉤枝藤總生物堿處理后可能改變了NSCLC所處的免疫微環(huán)境，進而影響NSCLC的發(fā)展進程并改善預后。這些核心模塊中的關鍵基因不僅參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還可能參與了鉤枝藤總生物堿改變NSCLC免疫微環(huán)境的過程。但其具體的調控機制有待進一步探索，值得在以后的研究中繼續(xù)探討。

本研究應用轉錄組測序技術對我國獨特的民族藥物鉤枝藤抗NSCLC的分子機制進行探索，獲取了一些與鉤枝藤抗NSCLC相關的潛在生物標志物和可能作用途徑，為進一步研究鉤枝藤抗NSCLC作用機制的實驗研究和臨床研究提供思路和線索。從轉錄組學數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，鉤枝藤總生物堿能夠顯著改變NCI-H1975細胞的表達譜，對NCI-H1975細胞的鐵死亡、氧化磷酸化、線粒體自噬等與癌癥進展關聯(lián)密切的信號通路產生了重要影響，同時還影響了NSCLC的免疫微環(huán)境。本研究已在NSCLC細胞轉錄組水平上對鉤枝藤總生物堿的影響進行了研究，未來需要進行更深層次的研究，如進一步分析蛋白質水平的表達差異，結合蛋白質組學進行深入探索，系統(tǒng)的分析鉤枝藤總生物堿對NSCLC細胞生物功能和免疫微環(huán)境的影響，將有助于進一步揭示鉤枝藤抗NSCLC的活性作用，并提供新的防治靶點及策略。綜上所述，鉤枝藤具有潛在的抗NSCLC活性作用，本研究為后續(xù)深入挖掘鉤枝藤抗NSCLC的分子機制和靶點，進一步開發(fā)高效低毒的創(chuàng)新藥物提供了理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of total alkaloids ofon expression profiles and immune microenviroment of non-small cell lung cancer cell lines

LI Zhong-yu1, 2, 3, ZHAO Yi-ran1, 2, 3, MEN Lei1, 2, 3, GONG Xiao-jie1, 2, 3, LI Ke-ke1, 2, 3

1. College of Life Sciences, Dalian Minzu University, Dalian 116600, China 2. Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization, Ministry of Education, Dalian 116600, China 3. Key Laboratory of Development and Application of Functional Components of Ethnic Medicines, Province of Liaoning, Dalian 116600, China

To evaluate the effect of total alkaloids ofon expression profile of non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines, screen out differentially expressed genes (DEGs) for analysis and mining the functional genes, in order to provide a theoretical basis for exploring the molecular mechanism of total alkaloids ofanti-lung cancer.NCI-H1975 cells of NSCLC were treated with total alkaloids of. RNA-Seq technology was used to perform whole transcriptome sequencing to obtain DEGs. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis for DEGs were performed. Key modules of differential genes were screened and their functions were analyzed, the impact of key genes on the survival of NSCLC were further analyzed. By analyzing of total alkaloids ofon NSCLC immune infiltration, correlation of key gene expression and immune infiltration level were determined.Transcriptome sequencing showed that total 2976 DEGs were identified of which 664 were up-regulated and 2312 were down-regulated in NCI-H1975 cells treated with total alkaloids of. Total alkaloids ofhad an important impact on signaling pathways mediated by ferroptosis, oxidative phosphorylation, mitochondria, lysosomes, gap junctions, nucleotide binding oligomerization domain (NOD)-like receptors. In the hub module, high expression of interleukin 11 () could reduce the overall survival rate of NSCLC, and was one of the poor prognostic factors of NSCLC patients; Interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 3 (), interleukin 7 receptor (), 2′,5′-oligoadenylate synthetase 2 (), radical-adenosyl methionine domain containing 2 (), receptor transporter protein 4 (), sterile alpha motif domain containing 9-like gene () and X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1 () expression levels could affect the purity of NSCLC tissue and type of immune cell infiltration, which may alter the immune microenvironment of NSCLC.Total alkaloids ofcould affect the transcriptional profile of NSCLC cells and have potential anti-NSCLC activity.

(Lour.) Merr.; non-small cell lung cancer; alkaloids; RNA-Seq; immune infiltration

R285.5

A

0253 - 2670(2022)17 - 5417 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.018

2022-04-01

國家自然科學基金資助項目（82173913）；國家自然科學基金資助項目（82104532）；2020年國家民委中青年英才項目

李中玉，博士，講師，研究方向為微流控器官芯片與天然藥物的研究開發(fā)。Tel: (0411)87188637 E-mail: lizhongyu2019@yeah.net

李珂珂，博士，碩士生導師，主要從事中藥及天然藥物的藥效物質基礎及作用機制研究。E-mail: like905219@163.com

[責任編輯 李亞楠]