不同炮制方法的巴戟天寡糖對骨質疏松模型雄性小鼠氧化應激和股骨組織形態的影響

莊文德，鐘 誠，陳浩諺，王東平，郭浩華，丁 平，晉大祥，謝煒星*

不同炮制方法的巴戟天寡糖對骨質疏松模型雄性小鼠氧化應激和股骨組織形態的影響

莊文德1，鐘 誠1，陳浩諺2，王東平1，郭浩華1，丁 平3，晉大祥4，謝煒星4*

1. 廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510006 2. 華南理工大學材料科學與工程學院，廣東 廣州 511400 3. 廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006 4. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院脊柱骨科，廣東 廣州 510405

探討巴戟天寡糖對環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）誘導骨質疏松雄性小鼠氧化應激指標和股骨組織形態的影響，并探析炮制工藝對巴戟天寡糖成分及效用的影響。對巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中成分進行提取分離并驗證。將雄性昆明小鼠隨機分為對照組、模型組、維生素D3（5 μg/kg）組及巴戟天寡糖低、高劑量（50、200 mg/kg）組和酒巴戟天寡糖低、高劑量（50、200 mg/kg）組。除對照組外，其余小鼠連續15 d ig CTX（4.5 mg/kg）制備骨質疏松模型，造模結束后，給予相應藥物干預4周，測定各組小鼠血清中谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；采用Micro-CT對股骨遠端骨微結構進行分析；采用三點彎曲法測定骨生物力學參數；制片測量骨組織形態計量學參數。巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖的6種寡糖成分的含量不同，巴戟天寡糖中-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量較酒巴戟天寡糖更多，而酒巴戟天寡糖中(+)-無水葡萄糖的含量更多。與模型組相比，巴戟天寡糖低劑量組小鼠股骨的骨密度顯著增加（＜0.01）；骨生物力學參數改善（＜0.05、0.01）；血清MDA水平降低（＜0.05）；松質骨的骨小梁面積比（percentage of trabecular bone area，Tb.Ar）、熒光標記周長比（percentage of fluorescent label perimeter，L.Pm）、骨礦化沉積率（mineral apposition rate，MAR）及骨形成率（bone formation rate to bone volume，BFR/BV）顯著升高（＜0.05、0.01），骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）和破骨細胞數目（number of osteoclast，OC.N）顯著降低（＜0.01）；皮質骨的MAR顯著降低（＜0.05），BFR/BV顯著升高（＜0.01）。巴戟天寡糖高劑量組小鼠骨密度顯著增加（＜0.01）；血清中CAT活性顯著升高（＜0.01）；松質骨組織中Tb.Ar顯著升高（＜0.05），Tb.Sp顯著降低（＜0.05）。酒巴戟天寡糖低劑量組小鼠骨密度顯著增加（＜0.01）；骨生物力學參數改善（＜0.05）；血清GSH-Px活性升高（＜0.01）；松質骨的Tb.Ar、L.Pm、MAR及BFR/BV顯著升高（＜0.05、0.01），Tb.Sp和OC.N顯著降低（＜0.05、0.01）；皮質骨的MAR顯著降低（＜0.05），BFR/BV顯著升高（＜0.05）。酒巴戟天寡糖高劑量組小鼠血清中CAT活性顯著升高（＜0.01），對于骨結構改變則無明顯影響作用。不同炮制工藝會影響巴戟天寡糖的成分含量。巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖均能不同程度地改善氧化應激指標，但低劑量的巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖對于改善CTX引起的骨質疏松的作用更為顯著。

巴戟天寡糖；酒炙；-果糖；蔗糖；1-蔗果三糖；耐斯糖；1F-果呋喃糖基耐斯糖；(+)-無水葡萄糖；氧化應激；骨質疏松

隨著老年化社會的來臨，男性骨質疏松癥（osteoporosis，OP）的發病率也逐年升高。據報道，50歲以上的群體中男性OP患病率為6.0%，需要進行防治的低骨量男性群體患病率高達46.9%[1]，而且伴隨年齡的增加，男性OP患者意外骨折后死亡率更高[2]，具有高危害性。現代研究表明人體衰老的發生發展與機體氧化應激水平緊密聯系[3]，而氧化應激是導致OP發病一大原因[4]。目前批準用于治療男性OP藥物主要是雙膦酸鹽類、活性維生素D制劑以及降鈣素類藥物，長期使用會出現不良反應，治療手段較局限[5-6]。根據《黃帝內經·素問》理論，人體的衰老、OP的發病均與腎陽虛衰有密切聯系。巴戟天How具有補腎陽、壯筋骨、祛風濕的功效。現代藥理學研究發現，巴戟天具有抗骨質疏松、抗炎、鎮痛、抗衰老、抗氧化等多種生物活性，而且酒炙炮制后，其效應會發生改變。此外，巴戟天寡糖作為巴戟天主要的藥效成分，其質量分數可占藥材干質量的10%以上[7-12]。基于此，本研究通過以巴戟天寡糖及酒制巴戟天寡糖干預環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）致OP雄性小鼠，考察其氧化應激指標及股骨骨密度、骨微結構變化，探究巴戟天寡糖抗OP作用及炮制工藝對巴戟天寡糖效應的影響，以期為研究男性OP的治療及巴戟天寡糖的進一步開發及臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性昆明小鼠，體質量（20±2）g，4周齡，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，生產許可證號SYXK（粵）2018-0085。動物飼養于室溫20～25 ℃、濕度40%～60%的環境中，室內照明以自然采光為主，通風良好，環境較安靜。動物實驗符合廣州中醫藥大學實驗動物倫理委員會規定，均符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

注射用CTX（批號9F312A）購自Baxter Oncology GmbH公司；維生素D3滴劑（批號20180401-1）購自杭州海王生物工程有限公司；巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖由廣州中醫藥大學中藥學院丁平教授提供；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（批號20191209）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號20191218）、過氧化氫酶（catalase，CAT）可見光試劑盒（批號20191214）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

Primaide高效液相色譜儀（日本日立高新技術公司）；UM5800型蒸發光散射檢測器（上海通微分析技術有限公司）；XR 205SM-DR型電子分析天平（瑞士Precisa公司）；DFT-200型高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；CQ-200型超聲波清洗器（上海音波聲電科技公司）；Eclipse TE2000-5型倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；BC-2800Vet型全自動動物血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；1510型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CT14RD型低速冷凍離心機（天美科學儀器有限公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；SkyScan 1276 Micro-CT掃描儀（美國Bruker公司）。

2 方法

2.1 巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中成分的驗證

2.1.1 樣品制備 分別取巴戟天寡糖、酒巴戟天寡糖各0.1 g，加入60%乙腈溶解并定容至10 mL，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2 色譜條件 Waters XBridgeTM Amide色譜柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm），流動相為0.2%三乙胺乙腈（A）-0.2%三乙胺水溶液（B），梯度洗脫：0～10 min，75%～70% A；10～20 min，70% A；20～45 min，70%～60% A；45～60 min，60% A；60～63 min，60%～75% A；63～75 min，75% A。體積流量為0.8 mL/min；進樣量為20 μL；蒸發光散射檢測器（ELSD）漂移管溫度為75 ℃；氮氣體積流量為2.0 L/min；柱溫為35 ℃。

2.2 動物分組、造模及給藥

動物適應性飼養1周后，隨機分為對照組、模型組、維生素D3（5 μg/kg）組及巴戟天寡糖低、高劑量（50、200 mg/kg）組和酒巴戟天寡糖低、高劑量（50、200 mg/kg）組，每組13只。除對照組外，其余各組小鼠ig CTX（4.5 mg/kg）制備OP模型[13]，對照組ig等體積的生理鹽水，1次/d，連續15 d。造模結束后，各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續4周。觀察各組小鼠的運動狀態、精神狀態、毛發外觀等變化。

2.3 各組小鼠血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平的檢測

給藥4周后，小鼠ip戊巴比妥鈉（1 mL/kg）后進行腹主動脈采血，全血于室溫放置，分層后3500 r/min離心10 min，取上層血清，按試劑盒說明書測定血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平。

2.4 各組小鼠股骨Micro-CT檢測

給藥結束后，小鼠ip戊巴比妥鈉（1 mL/kg）安樂死，逐層分離骨組織肌肉，取右側股骨行Micro-CT連續掃描，掃描參數：電流100 μA；電壓80 kV；掃描厚度15 μm；濾片0.5 mm；掃描方向沿股骨長軸掃描股骨遠端，最終獲取連續平面Micro-CT圖像。掃描完成后在主機上選出股骨遠端1.5 mm的區域為感興趣區域（range of interests，ROI），在配套軟件上分析骨密度。

2.5 各組小鼠股骨生物力學性能的測定

用游標卡尺測量小鼠股骨的長度、短軸寬度和長軸寬度，用萬能材料試驗機進行三點彎曲試驗，測定骨骼的最大載荷、最大撓度、最大應力、最大應變和能量吸收值。

2.6 各組小鼠松質骨及皮質骨形態計量學分析

取各組小鼠松質骨及皮質骨，制備不脫鈣骨組織塑料切片，并對組織切片進行測量，進行骨組織形態計量學分析。分別測量并計算骨小梁面積比（percentage of trabecular bone area，Tb.Ar）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）、皮質骨面積比（percentage of cortical bone area，Ct.Ar）、骨髓腔面積比（percentage of marrow-cavity area，Ma.Ar）、熒光標記周長比（percentage of fluorescent label perimeter，L.Pm）、骨礦化沉積率（mineral apposition rate，MAR）、骨形成率（bone formation rate to bone volume，BFR/BV）和破骨細胞數目（number of osteoclast，OC.N）等參數。

2.7 統計學分析

3 結果

3.1 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖的成分分析

如圖1和表1所示，巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中6種寡糖的含量不同，巴戟天寡糖中-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量較酒巴戟天寡糖更多，而酒巴戟天寡糖中(+)-無水葡萄糖的含量更多。

3.2 動物行為學觀察

與對照組比較，模型組小鼠毛發稀疏干枯，懶動思臥，精神狀態欠佳。與模型組比較，各給藥組小鼠精神狀態好轉，毛發較光亮。對照組小鼠無死亡，模型組死亡2只，維生素D3組死亡1只，巴戟天寡糖低劑量組死亡2只，巴戟天寡糖高劑量組無死亡，酒巴戟天寡糖低劑量組無死亡，酒巴戟天寡糖高劑量組死亡3只。

1-D-果糖 2-D(+)-無水葡萄糖 3-蔗糖 4-1-蔗果三糖 5-耐斯糖 6-1F-果呋喃糖基耐斯糖

表1 巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中6種寡糖成分

Table 1 Six oligosaccharides in M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides

組別質量分數/(mg·g?1) D-果糖D(+)-無水葡萄糖蔗糖1-蔗果三糖耐斯糖1F-果呋喃糖基耐斯糖 巴戟天寡糖62.0206.39573.93064.869100.854148.458 酒巴戟天寡糖56.22925.09767.92239.45088.319141.863

3.3 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中GSH-Px和CAT活性均顯著降低（＜0.05、0.01），MDA水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，維生素D3組小鼠血清中GSH-Px和CAT活性均顯著升高（＜0.05），MDA水平顯著降低（＜0.05）；巴戟天寡糖低劑量組小鼠血清中MDA水平顯著降低（＜0.05）；巴戟天寡糖高劑量組小鼠血清中CAT活性顯著升高（＜0.01）；酒巴戟天寡糖低劑量組小鼠血清中GSH-Px活性顯著升高（＜0.01）；酒巴戟天寡糖高劑量組小鼠血清中CAT活性顯著升高（＜0.01）。

表2 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平的影響()

Table 2 Effect of M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides on GSH-Px, CAT activities and MDA level in serum of OP mice ()

組別劑量/(mg·kg?1)n/只GSH-Px/(μmol·L?1)CAT/(U·mL?1)MDA/(nmol·mL?1) 對照—13629.05±92.997.89±1.954.31±2.32 模型—11553.54±68.21#3.38±0.64##7.84±4.79# 維生素D3—12658.01±50.99*7.38±0.75*4.03±2.56* 巴戟天寡糖5011610.29±72.195.49±2.255.69±2.26* 20013604.98±58.337.37±2.44**6.16±2.88 酒巴戟天寡糖5013707.23±97.83**6.31±2.757.28±1.87 20010563.70±126.208.57±1.88**6.80±2.18

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.4 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨微結構的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠皮質骨變薄，骨髓腔增大，骨小梁網狀結構退化，呈現出明顯的骨微結構破壞。與模型組比較，各給藥組小鼠皮質骨面積增加，骨髓腔縮小，骨小梁數量、寬度、長度、形態部分恢復，密度和網狀結構聯結性增加。其中，巴戟天寡糖低劑量組和酒巴戟天寡糖低劑量組基本達到對照組水平，與維生素D3組基本一致。

圖2 各組小鼠股骨遠端Micro-CT X-Y三維剖面圖

3.5 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨骨密度的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠股骨骨密度顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，除酒巴戟天寡糖高劑量組外，其余各給藥組小鼠股骨骨密度均顯著升高（＜0.01）。

表3 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨骨密度的影響()

Table 3 Effect of M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides on femoral bone density of OP mice ()

組別劑量/(mg·kg?1)n/只骨密度/(g·cm?2) 對照—130.098±0.009 模型—110.054±0.005## 維生素D3—120.076±0.005** 巴戟天寡糖50110.097±0.013** 200130.081±0.010** 酒巴戟天寡糖50130.093±0.018** 200100.056±0.018

3.6 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨生物力學性能的影響

如表4所示，與對照組比較，模型組小鼠股骨的最大載荷、最大應力及最大應變均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組相比，維生素D3組、巴戟天寡糖低劑量組和酒巴戟天寡糖低劑量組小鼠股骨的最大應力及最大應變均顯著升高（＜0.05、0.01）；巴戟天寡糖低劑量組小鼠股骨的最大載荷顯著升高（＜0.05）。

3.7 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨形態計量學參數的影響

如表5所示，與對照組比較，模型組小鼠松質骨組織中Tb.Th無顯著變化，但Tb.Ar、Tb.N、L.Pm、MAR和BFR/BV均顯著降低（＜0.01），Tb.Sp和OC.N顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，維生素D3組、巴戟天寡糖低劑量組和酒巴戟天寡糖低劑量組小鼠松質骨組織中Tb.Ar、L.Pm、MAR、BFR/BV顯著升高（＜0.05、0.01），Tb.Sp和OC.N顯著降低（＜0.05、0.01）；巴戟天寡糖高劑量組小鼠松質骨組織中Tb.Ar顯著升高（＜0.05），Tb.Sp顯著降低（＜0.05）。

表4 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨生物力學性能的影響()

Table 4 Effect of M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides on biomechanical properties of femurs in OP mice ()

組別劑量/(mg·kg?1)n/只最大載荷/N最大撓度/mm最大應力/MPa最大應變/%能量吸收值/J 對照—13135.5±20.21.05±0.46103.5±26.14.52±0.650.075±0.018 模型—1199.5±15.3#0.93±0.1283.0±18.5#2.23±0.23##0.058±0.012 維生素D3—12113.2±17.51.03±0.38102.5±16.7*4.32±0.31**0.065±0.015 巴戟天寡糖5011123.9±19.3*1.04±0.44101.8±14.9*4.21±0.32**0.064±0.017 20013110.3±14.80.94±0.1694.6±0.02.51±0.260.059±0.016 酒巴戟天寡糖5013116.8±16.71.00±0.33102.8±14.9*3.94±0.37*0.064±0.011 20010101.6±13.60.82±0.1586.7±20.12.66±0.940.060±0.012

表5 各組小鼠松質骨靜態和動態參數的變化()

Table 5 Changes of static and dynamic parameters in cancellous bone of mice in each group ()

組別劑量/(mg·kg?1)n/只 Tb.Ar/%Tb.Th/μmTb.N/mm?1Tb.Sp/μmL.Pm/%MAR/(μm·d?1)BFR/BV/%OC.N/mm2 對照—13 20.5±7.352.5±12.33.1±0.9286.4±28.518.0±5.48.5±0.2276.2±35.64.0±1.5 模型—11 5.5±1.2##49.6±15.60.9±0.1##470.9±63.6##9.5±3.6##4.5±0.1##123.1±20.5##19.5±3.6## 維生素D3—12 8.6±1.3*50.6±11.31.0±0.3305.8±31.4**15.2±3.7*6.5±0.3*256.8±10.3**10.2±2.0** 巴戟天寡糖5011 10.5±2.3**52.5±18.21.0±0.4310.3±32.1**16.3±5.5*6.3±0.2*256.5±20.6**10.0±1.9** 20013 9.5±1.6*48.5±14.60.9±0.1350.1±37.6*10.1±4.84.7±0.1166.5±20.418.3±1.3 酒巴戟天寡糖5013 11.5±2.4**53.6±16.41.0±0.3365.7±26.1*16.2±5.5*6.4±0.2*242.9±31.3**11.7±2.6** 20010 5.9±1.449.7±12.40.8±0.1471.0±94.510.7±2.54.6±0.2155.9±29.217.0±2.3

如表6所示，與對照組比較，模型組小鼠皮質骨中Ct.Ar、L.Pm、MAR及BFR/BV均顯著降低（＜0.05、0.01），Ma.Ar顯著增加（＜0.01），提示CTX誘導雄性小鼠皮質骨變薄，骨量丟失，生成速度減慢。與模型組比較，維生素D3組、巴戟天寡糖低劑量組和酒巴戟天寡糖低劑量組小鼠皮質骨組織中Ma.Ar顯著降低（＜0.05），BFR/BV顯著升高（＜0.05、0.01）。

表6 各組小鼠皮質骨靜態和動態參數的變化()

Table 6 Changes of static and dynamic parameters in cortical bone of mice in each group ()

組別劑量/(mg·kg?1)n/只Ct.Ar/%Ma.Ar/%L.Pm/%MAR/(μm·d?1)BFR/BV/% 對照—1370.5±7.320.6±4.333.5±3.64.4±0.573.1±10.5 模型—1155.5±11.4#29.6±5.6##25.2±5.4#2.8±0.1#56.4±5.6## 維生素D3—1256.8±8.323.6±5.3*26.0±3.03.1±0.364.8±5.3* 巴戟天寡糖501156.5±9.323.5±4.2*26.3±5.23.1±0.269.5±4.2** 2001359.5±8.628.5±4.625.1±4.72.9±0.156.5±6.2 酒巴戟天寡糖501357.5±10.424.6±6.4*27.3±3.33.0±0.262.9±4.6* 2001058.4±8.429.7±2.426.7±2.62.4±0.254.9±6.3

4 討論

《素問·上古天真論》曾言“丈夫······六八陽氣衰竭于上，面焦，發鬢頒白。七八肝氣衰，筋不能動。八八天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極，則齒發去”。男性在生長發育以及衰老過程中需要耗損大量陽氣，其中又以腎陽耗損最重[14]。《素問·陰陽別論篇》中云：“陽氣虛，則為偏枯。陽虛而不能養筋，則為痿”。腎陽虛衰，無以溫煦濡養筋脈骨骼，甚則骨枯髓減，進展為“骨痿”。由此可見，運用補腎陽法干預男性OP的發病及進展具有中醫理論上的依據。

現代研究表明，機體進入衰老狀態后，骨微環境中增多的促炎性分泌蛋白會導致OP的發生[15]，而衰老是細胞內成分累積性氧化損傷的結果，因此機體抗氧化系統對于延緩衰老及防治OP至關重要[16]。既往研究發現CTX具有生殖毒性、骨質疏松等不良反應，不少研究者利用CTX構建與衰老、骨質疏松、組織高氧化應激狀態等相關小鼠模型[12,17]。因此，本研究利用CTX干預雄性昆明小鼠構建OP模型，發現模型小鼠具有骨密度下降、骨量嚴重丟失、骨微結構破壞、氧化應激指標升高等特點，可用于模擬男性OP機體狀態。

有學者發現臨床上運用補腎陽法治療男性OP患者，能夠有效改善骨密度及骨代謝指標[18]，但其具體機制尚不明確。目前，大量研究表明肉蓯蓉、淫羊藿、杜仲等補腎陽中藥能夠提高雄性實驗鼠體內組織中GSH-Px活性，降低MDA水平，延緩或逆轉其組織的氧化損傷，還能夠提高骨骼質量、骨密度，改善骨小梁結構等[19-24]，更進一步地揭示了男性OP的發病與氧化應激具有一定聯系，但目前從氧化應激角度探討男性OP的發病及治療的研究仍相對較少。因此，本研究使用巴戟天寡糖干預CTX致OP的雄性小鼠，發現其可以有效改善實驗小鼠的骨密度、持續骨丟失及骨微結構破壞的現象，同時調節血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平。本研究還發現與維生素D3相比，巴戟天寡糖在改善骨密度上效果更明顯，在改善其余OP及氧化應激指標上則作用相近，表明巴戟天寡糖具有較好的抗OP及改善氧化應激作用，而且可能通過調節雄性實驗鼠體內氧化應激發揮抗OP作用，但這仍需進一步實驗證實。

研究發現，炮制后的巴戟天化學成分與作用效果發生改變，巴戟天酒炙后在機體能量代謝上具有與鹽炙相似的炮制增效作用，且作用較鹽炙更優；巴戟天酒炙后寡糖對生精障礙雄性小鼠生殖氧化應激作用明顯優于生巴戟天寡糖[12,25-26]。本研究發現巴戟天寡糖與酒巴戟天寡糖在6種寡糖成分的含量上均有不同，巴戟天寡糖中-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量較酒巴戟天寡糖更多，而酒巴戟天寡糖中(+)-無水葡萄糖的含量更多。

本研究結果顯示，巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖均有較好的抗OP及改善氧化應激作用，但巴戟天寡糖改善血清MDA水平更顯著，酒巴戟天寡糖在改善GSH-Px指標上更為明顯。低劑量的巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖能夠升高CTX致OP小鼠松質骨的Tb.Ar、L.Pm、MAR和BFR/BV，顯著降低Tb.Sp和OC.N，一定程度上恢復變薄的皮質骨，減少皮質骨量丟失，增加皮質骨生成速度，與維生素D3作用相近，具有較好的抗OP作用。這可能是巴戟天寡糖調控骨保護素/核因子κB受體活化因子配體/核因子κB受體活化因子（osteoprotegerin/ receptor activator of nuclear factor-κB/receptor activator of nuclear factor κB ligand，OPG/RANK/ RANKL）通路從而發揮抗OP的作用[27]，但炮制后巴戟天寡糖的寡糖成分含量發生改變和劑量的不同，也影響其效用發揮，目前相關研究較少，其潛在機制尚不明確，這也提示可以進一步探討巴戟天寡糖中不同寡糖成分的作用及效應機制，以明確巴戟天抗骨質疏松的有效成分及具體機制。

目前，臨床上尚無針對男性OP的專門用藥，且許多含有補腎陽藥的抗OP藥物服用周期往往較長，一般為3～6個月，患者容易出現口干、便秘、面紅等不良反應，無法長期服用[28]。同時，中藥飲片質量良莠不齊，便攜性差，也影響了其推廣與使用[29]。巴戟天寡糖具有低熱、穩定、安全無毒等良好理化性質，并且已有中成藥制劑應用于臨床[30]，在抗OP方面具有較好的應用前景。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中華醫學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會. 中國骨質疏松癥流行病學調查及“健康骨骼”專項行動結果發布 [J]. 中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志, 2019, 12(4): 317-318.

[2] Fuggle N R, Curtis B, Clynes M,. The treatment gap: The missed opportunities for osteoporosis therapy [J]., 2021, 144: 115833.

[3] 丁宇, 王彥豐, 左夏林, 等. 細胞自噬與人體衰老調控的關聯性研究進展 [J]. 國際老年醫學雜志, 2022, 43(2): 223-227.

[4] 何紅梅, 覃冬云. 輔酶Q10治療骨質疏松的研究進展 [J]. 中國處方藥, 2022, 20(2): 176-178.

[5] 中華醫學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會. 男性骨質疏松癥診療指南 [J]. 中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志, 2020, 13(5): 381-395.

[6] 于龍, 王亮. 老年骨質疏松癥現狀及進展 [J]. 中國臨床保健雜志, 2022, 25(1): 6-11.

[7] Zhu J Y, Peng Q W, Xu Y,.oligosaccharides ameliorate depressive-like behaviors in poststroke rats through upregulating GLUT3 to improve synaptic activity [J]., 2020, 34(10): 13376-13395.

[8] Xia T S, Dong X, Lin L Y,. Metabolomics profiling provides valuable insights into the underlying mechanisms ofon protecting glucocorticoid-induced osteoporosis [J]., 2019, 166: 336-346.

[9] Zhang Q, Zhang J H, He Y Q,. Iridoid glycosides fromHow. exert anti-inflammatory and anti-arthritic effects through inactivating MAPK and NF-κB signaling pathways [J]., 2020, 20(1): 172.

[10] Yang X, Chen D L, Chen T L,Oligosaccharides fromslow the progress of aging mice by regulating the key microbiota-metabolite pairs [J]., 2019, 2019: 9306834

[11] Shi Y, Liu X Y, Jiang Y P,. Monotropein attenuates oxidative stress via Akt/mTOR-mediated autophagy in osteoblast cells [J]., 2020, 121: 109566.

[12] 劉夢云, 秦祎苒, 劉秋怡, 等. 基于正交試驗設計-熵權逼近理想解排序法 (TOPSIS) 優選巴戟天酒炙工藝及炮制前后藥效對比研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(20): 6208-6215.

[13] 吳鐵, 劉鈺瑜, 崔燎, 等. 不同劑量的環磷酰胺對大鼠骨藥理作用探討 [J]. 中國藥理學通報, 2001, 17(3): 329-333.

[14] 王琦. 王琦男科學 [M]. 鄭州: 河南科學技術出版社, 1997: 89.

[15] 倪乙洪, 王正博, 劉權, 等. 細胞衰老在老年骨質疏松癥防治中的研究進展 [J]. 中國骨質疏松雜志, 2020, 26(8): 1207-1211.

[16] 何毓婕, 曲濤, 王桐, 等. 松花粉對環磷酰胺致卵巢早衰大鼠的卵巢保護作用 [J]. 天然產物研究與開發, 2022, 34(6): 1005-1013.

[17] 劉俐, 何清湖, 唐宇, 等. 龜甲膠對腎陰虛大鼠抗氧化活性和Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 [J]. 世界科學技術—中醫藥現代化, 2021, 23(5): 1406-1414.

[18] 邵鵬, 丁旭鋒, 顧建林, 等. 中西醫結合治療中老年男性骨質疏松癥臨床研究 [J]. 中國醫藥科學, 2020, 10(19): 52-54.

[19] 郭俏儷, 武志博, 周玉碧, 等. 蘭州肉蓯蓉多糖的組成分析及抗氧化活性 [J]. 食品工業科技, 2021, 42(15): 96-103.

[20] 李金濤, 李時軍, 宋章興, 等. 富硒當歸淫羊藿方對大鼠睪丸SOD、MDA及血清性激素的影響 [J]. 中國醫藥導報, 2021, 18(4): 9-13.

[21] 王勝超, 李本科, 闞玉璇, 等. 杜仲補天素膠囊劑對腺嘌呤誘導的雄性大鼠生殖功能損傷的影響 [J]. 中華男科學雜志, 2020, 26(1): 63-73.

[22] 徐雙華, 吳清. 肉蓯蓉復方顆粒對大鼠骨質疏松癥的治療作用 [J]. 中南藥學, 2021, 19(9): 1854-1858.

[23] 張永勝, 熊福生, 何濃, 等. 淫羊藿治療骨質疏松的研究進展 [J]. 河南外科學雜志, 2021, 27(6): 164-167.

[24] 李敏啟, 杜娟, 楊盼盼, 等. 氧化應激調控骨質疏松癥的研究進展 [J]. 山東大學學報: 醫學版, 2021, 59(6): 16-24.

[25] 吳文輝, 管莉, 魏玉玲, 等. 基于能量代謝的巴戟天鹽、酒炙炮制增效作用對比研究 [J]. 中醫藥臨床雜志, 2021, 33(9): 1750-1753.

[26] 史娟蘭. 炮制對巴戟天化學成分影響的研究進展 [J]. 東南園藝, 2019, 7(6): 66-70.

[27] 陳浩諺. 巴戟天寡糖對去卵巢骨質疏松大鼠骨微結構和骨組織OPG、RANKL表達影響的研究 [D]. 廣州: 廣州中醫藥大學, 2021.

[28] 魏戌, 謝雁鳴, 張春和, 等. 中藥治療男性骨質疏松癥的臨床文獻研究 [J]. 世界中醫藥, 2018, 13(2): 492-495.

[29] 吳迪, 林逸軒, 李金菊, 等. 中醫藥治療骨質疏松癥近10年臨床研究進展 [J]. 中醫藥臨床雜志, 2019, 31(11): 2038-2041.

[30] 曹重陽, 韓露, 王克, 等. 巴戟天寡糖聯合帕羅西汀治療抑郁癥臨床評價 [J]. 中國藥業, 2020, 29(6): 148-150.

Effect ofoligosaccharides concocted by different methods on oxidative stress and femoral tissue morphology in osteoporotic male mice

ZHUANG Wen-de1, ZHONG Cheng1, CHEN Hao-yan2, WANG Dong-ping1, GUO Hao-hua1, DING Ping3, JIN Da-xiang4, XIE Wei-xing4

1. The First Clinical School, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2. School of Materials Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 511400, China 3. School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 4. Department of Spinal Surgery, The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China

To investigate the effects ofoligosaccharides (MO) on oxidative stress indexes and femoral tissue morphology in male mice with cyclophosphamide (CTX)-induced osteoporosis, and explore the effects of processing technology on the composition and efficacy of MO.The components in MO and wineoligosaccharides (WMO) were extracted, separated and verified. Male Kunming mice were randomly divided into control group, model group, vitamin D3(5 μg/kg) group, MO low-and high-dose (50, 200 mg/kg) groups, WMO low-and high-dose (50, 200 mg/kg) groups. Except for control group, the other mice were continuously ig CTX (4.5 mg/kg) for 15 d to establish osteoporosis models. After the modeling, mice were given corresponding drug for 4-week intervention, glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) activities and malondialdehyde (MDA) level in serum of mice in each group was measured; Micro-CT was used to analyze distal femur bone microstructure; Three-point bending method was used to determine bone biomechanical parameters; Slices were used to measure bone histomorphometric parameters.MO and WMO had different contents of six kinds of oligosaccharides. Contents of-fructose, sucrose, 1-fructose, nystose and 1F-fructofuranosylnystose in MO was higher than that of WMO, while content of(+)-anhydroglucose was higher in WMO. Compared with model group, bone mineral density of femur of mice in WO low-dose group was significantly increased (< 0.01), bone biomechanical parameters were improved (< 0.05, 0.01), MDA level in serum was decreased (< 0.05); Percentage of trabecular bone area (Tb.Ar), percentage of fluorescent label perimeter (L.Pm), mineral apposition rate (MAR) and bone formation rate to bone volume (BFR/BV) in cancellous bone were significantly increased (< 0.05, 0.01), trabecular separation (Tb.Sp) and number of osteoclasts (OC.N) were significantly decreased (< 0.01); MAR in cortical bone was significantly decreased (< 0.05), and BFR/BV was significantly increased (< 0.01). Bone mineral density of mice in MO high-dose group was significantly increased (< 0.01), CAT activity in serum was significantly increased (< 0.01), Tb.Ar in cancellous bone tissue was significantly increased (< 0.05), Tb.Sp was decreased (< 0.05). Bone mineral density in WMO low-dose group was significantly increased (< 0.01), bone biomechanical parameters were improved (< 0.05), GSH-Px activity in serum was increased (< 0.01); Tb.Ar, L.Pm, MAR and BFR/BV in cancellous bone were significantly increased (< 0.05, 0.01), Tb.Sp and OC.N were significantly decreased (< 0.05, 0.01); MAR in cortical bone was significantly decreased (< 0.05), BFR/BV was significantly increased (< 0.05). CAT activity in serum of mice in WMO high-dose group was significantly increased (< 0.01), but had no significant effect on the changes of bone structure.Different processing techniques can affect the content of MO. MO and WMO can improve oxidative stress indicators to varying degrees, but effect of low dose MO and WMO on improving CTX-induced osteoporosis are more significant.

oligosaccharides; wine process;-fructose; sucrose; 1-fructose; nystose; 1F-fructofuranosylnystose;(+)-anhydroglucose; oxidative stress; osteoporosis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)17 - 5409 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.017

2022-04-22

國家自然科學基金資助項目（82074007）

莊文德，碩士研究生，研究方向為中醫藥防治骨質疏松。Tel: 15768884884 E-mail: 20201120142@stu.gzucm.edu.cn

謝煒星，副主任醫師，研究方向為脊柱外科及骨質疏松防治。Tel: 13560079199 E-mail: xwx841211@163.com

[責任編輯 李亞楠]