鐵筷子揮發油對慢性腦缺血致血管性認知功能障礙大鼠的作用及機制研究

丁曉麗，薛丁嘉，鄧萬娟，韓彩瑤，劉曉龍，李 媛，錢海兵*

鐵筷子揮發油對慢性腦缺血致血管性認知功能障礙大鼠的作用及機制研究

丁曉麗1, 2, 3，薛丁嘉1, 2，鄧萬娟1, 2，韓彩瑤1, 2，劉曉龍1, 2，李 媛1，錢海兵1, 2*

1. 貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025 2. 貴州省中醫藥方證藥理研究特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025 3. 龍巖市中醫院，福建 龍巖 364030

探究苗藥鐵筷子[臘梅及山臘梅的干燥根]揮發油對慢性腦缺血（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）致血管性認知功能障礙（vascular cognitive impairment，VCI）大鼠的作用及機制。采用改良的雙側頸總動脈結扎（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）法建立CCH模型，將造模成功大鼠隨機分為模型組及鐵筷子揮發油高、中、低劑量（80、40、20 mg/kg）組和丁苯酞（63 mg/kg）組，另設假手術組，給予相應藥物干預28 d，采用水迷宮實驗檢測各組大鼠學習記憶能力；采用曠場實驗、Y迷宮實驗檢測各組大鼠自主活動性和新奇事物探索能力；采用蘇木素-伊紅（HE）染色、Nissl染色、TUNEL染色觀察各組大鼠大腦皮層及海馬CA1區神經細胞結構變化、尼氏小體以及凋亡細胞數量變化；采用ELISA法檢測各組大鼠血清中腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平；采用比色法檢測各組大鼠海馬組織中乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和乙酰膽堿轉移酶（cholineacetyltransferase，ChAT）的活性；采用Western blotting法檢測各組大鼠海馬組織中BDNF、酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）、磷酸化TrkB（phosphorylated TrkB，p-TrkB）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）蛋白表達。與模型組比較，鐵筷子揮發油組大鼠逃避潛伏期縮短（＜0.05、0.01），穿越平臺次數和跨格次數提高（＜0.05、0.01），在新異臂所待時間延長（＜0.05）；神經細胞結構的變性得到改善，腦組織中尼氏小體的數量提高（＜0.05），細胞凋亡減少（＜0.05）；血清中BDNF水平及海馬組織中ChAT活性升高（＜0.05、0.01），海馬組織中AChE活性降低（＜0.05）；海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），Caspase-3蛋白表達水平降低（＜0.05）。苗藥鐵筷子揮發油可以改善CCH致VCI大鼠認知功能障礙，其作用機制可能與激活BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號通路有關。

鐵筷子揮發油；慢性腦缺血；血管性認知功能障礙；腦源性神經營養因子；酪氨酸激酶受體B；磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路

慢性腦缺血（hronic cerebral hypoperfusion，CCH）是腦內血流量降低的一種病理狀態，其中CCH所致的血管性認知功能障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是誘發血管性癡呆的主要危險因素[1]。VCI的嚴重程度與腦內血流灌注不足呈正相關，反映了從輕度認知功能障礙到嚴重癡呆的整個發展進程，若長期發展即可導致缺血性腦卒中、阿爾茨海默病、Binswanger病等腦血管疾病的發生[2]。因此及時干預并治療VCI是十分必要的。研究表明腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）/酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）信號通路與腦內神經元增殖、分化、存活以及神經遞質釋放密切相關，其下游磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路對神經元細胞的存活有明顯的促進作用[3-4]。許多中藥揮發油如益智仁揮發油、辛夷揮發油、當歸揮發油、桂枝湯揮發油等在改善認知障礙方面具有潛在優勢，能夠提高學習記憶能力[5-8]。苗藥鐵筷子是臘梅科臘梅屬植物臘梅(L.) Link及山臘梅Oliv.的干燥根，味辛性溫，具有祛風止痛、理氣活血的功效，其提取的揮發油氣辛香，芳香療法已被證實可以通過嗅覺的刺激改善認知障礙，且揮發油較易通過血腦屏障，其中含量前3的為蓖麻油酸、棕櫚酸、油酸，多為不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸在腦血管方面的治療中有顯著療效[9]。本課題前期研究表明，鐵筷子揮發油具有極強的抗炎作用，之后又對其同屬植物山臘梅葉的揮發油進行研究，發現其對癡呆大鼠的認知記憶具有明顯改善作用[10-11]。因此本研究采用改良的雙側頸總動脈永久結扎（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）法建立CCH大鼠模型，水迷宮篩選出CCH致VCI大鼠，探究苗藥鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠的認知功能障礙的改善作用及機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量280～300 g，8周齡，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2019-0014，動物合格證號No. 430726200100285985。動物實驗經貴州中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會批準（批準號20210056）。

1.2 藥材

苗藥鐵筷子購自貴陽萬東橋藥材市場，經貴州中醫藥大學藥學院劉曉龍博士鑒定為臘梅科臘梅屬植物臘梅(L.) Link的干燥根。

1.3 藥品與試劑

丁苯酞軟膠囊（批號1182005116）購自石藥集團恩必普藥業有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號20190929）、Nissl染色試劑盒（批號20210712）、BCA蛋白定量試劑盒（批號20210717）、牛血清白蛋白（批號212D051）購自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（批號030521210615）購自上海碧云天生物技術有限公司；Omni-EasyTM一步法PAGE凝膠快速制備試劑盒（批號02561150）、Omni-ECL超靈敏化學發光檢測試劑盒（批號02581060）購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司；乙酰膽堿轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）試劑盒（批號20210816）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）檢測試劑盒（批號20210806）購自南京建成生物工程研究所；BDNF試劑盒（批號6C3GRQT3BJ）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號AA16201）購自南京巴傲得生物科技有限公司；β-actin抗體（批號00097048）購自美國Protrintech公司；BDNF抗體（批號3507448002）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；磷酸化TrkB（phosphorylated TrkB，p-TrkB）抗體（批號4621T）、p-Akt兔多克隆抗體（批號9018T）購自美國CST公司；TrkB抗體（批號GR3360045-3）、PI3K抗體（批號GR277867-1）、Akt抗體（批號GR240003-94）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號GR3241586-3）購自英國Abcam公司。

1.4 儀器

DRT-TW型電熱套（鄭州長城科工貿有限公司）；JJ224B型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；DNS-2型Morris水迷宮設備（中國醫學科學院藥物研究所）；SMART 3.0曠場實驗設備、Y型迷宮實驗設備（美國Panlab公司）；YZB/0009-2003型組織包埋機、RM2265型組織切片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；SLK-O3000-S型搖床（美國Scilogex公司）；XH-D型渦旋混合器（江蘇天翎儀器有限公司）；XK-400型低溫高速離心機（江蘇新康醫療器械有限公司）；DKZ-2型電熱恒溫水槽（上海精宏試驗設備有限公司）；EPS300型電泳儀、VE-180型電泳槽（上海天能科技有限公司）；InfiniteM200型酶標儀（北京新風機電技術公司）；ChemiDocTMTouch超靈敏多功能化學發光成像系統曝光機（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 鐵筷子揮發油的制備

取粉碎的鐵筷子藥材100 g，置2 L圓底燒瓶中，加入10倍量水，浸泡過夜，采用水蒸氣蒸餾法制備，取所得揮發油，經無水硫酸鈉干燥，置于棕色玻璃瓶中備用，所得鐵筷子揮發油為淡黃色油狀物，具辛香氣味，提取率為0.8%。參照高源等[12]提取方法，經氣相色譜-質譜檢測發現黔產鐵筷子揮發油中主要成分為棕櫚酸，質量分數為38.496%，其余主要成分為亞油酸16.996%、油酸14.586%、α-杜松醇9.028%、氧化石竹烯5.654%。

2.2 動物造模及篩選

采用改良的BCCAO方法進行造模[13]，大鼠ip 20%烏拉坦（6 mL/kg）麻醉，頸部備皮、消毒，在頸部左側處皮膚做縱向切口，分離左側頸總動脈，用4-0手術尼龍線結扎頸總動脈的近心端和遠心端，并用眼科剪在中間剪斷，隨后逐層縫合，碘伏消毒；1周后，在右側進行同樣的操作。假手術組不結扎雙側頸總動脈，其余操作與造模大鼠保持一致。造模1周后，使用水迷宮實驗篩選造模成功大鼠，以假手術組大鼠逃避潛伏期均值為參考值，若造模大鼠的逃避潛伏期與假手術組大鼠逃避潛伏期之差占該鼠逃避潛伏期的比例＞20%則定為造模成功的CCH致VCI大鼠[14]。

2.3 分組及給藥

將造模成功大鼠隨機分為模型組及鐵筷子揮發油高、中、低劑量（80、40、20 mg/kg）組和丁苯酞（63 mg/kg）組，每組12只。各給藥組ig相應藥物（5 mL/kg），假手術組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，共28 d。給藥結束后，每組隨機選取8只大鼠進行后續行為學和生化檢測，剩余4只大鼠進行病理組織檢測。

2.4 行為學檢測

2.4.1 Morris水迷宮實驗

（1）定位航線實驗：實驗開始的時候，將安全島放置在1個固定的象限即第II象限，將大鼠面向池壁放入水池，大鼠入水點順序：第1天，I→II→III→IV；第2天，II→III→IV→I；第3天，III→IV→I→II；第4天，IV→I→II→III；第5天，I→II→IV→III。第1天為適應性訓練不記錄成績，后4天記錄大鼠在120 s內，從不同入水點爬上平臺消耗的時間，即逃避潛伏期。若大鼠在120 s內爬上平臺，則讓大鼠在平臺停留15 s；若大鼠在120 s內未能找到平臺，則可以適當引導大鼠爬上平臺并停留15 s，逃避潛伏期相應地記錄為120 s[15]。

（2）空間探索實驗：在定位航行實驗第6天，撤除安全島平臺，將大鼠從IV象限面向池壁放入水中，記錄大鼠2 min內跨越原平臺位置的次數。

2.4.2 曠場實驗 將大鼠放入箱內底面中心，觀察大鼠在5 min內的行為變化情況及其探索軌跡。每只動物檢測結束后，需用酒精擦拭整個箱子，避免本次檢測對下一只動物的影響與干擾。

2.4.3 Y迷宮實驗 使用隔板封閉新異臂，讓大鼠在另外2個臂中自由探索8 min，大鼠初進迷宮時所在的臂為起始臂，另一臂稱為其他臂，2 h后移開隔板，讓大鼠在3個臂中自由探索10 min，記錄并比較大鼠在各個臂中停留的時間[16]。

2.5 取材

行為學測試完成后，麻醉大鼠，打開大鼠腹腔，分離腹主動脈，以7號采血針配合5 mL真空紅帽采血管進行取血，靜置分離血清，分裝于EP管中，置于?80 ℃保存備用，取血完畢后迅速轉移至冰上取腦，分離海馬，置于?80 ℃保存，用于后續檢測；剩余的4只大鼠對其進行灌注取腦，固定于4%多聚甲醛中用于后續病理組織檢測。

2.6 HE染色觀察皮層及海馬CA1區神經細胞形態變化

腦組織于4%多聚甲醛固定48 h后，切取視交叉至乳頭體之間的部分，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），脫蠟至水，蘇木素染色5 min，分化10 s，伊紅染色1 min，封片，于顯微鏡下觀察神經細胞形態。

2.7 Nissl染色觀察皮層及海馬CA1區尼氏小體數量

取“2.6”項下制備的腦組織切片，脫蠟至水，滴染亞甲藍染色液10 min，分化1 min，鉬酸銨溶液處理5 min，封片，于顯微鏡下觀察尼氏小體數量，采用Image Lab軟件計數。

2.8 TUNEL染色觀察皮層及海馬CA1區神經細胞凋亡情況

取“2.6”項下制備的大鼠腦組織切片，脫蠟至水，加入蛋白酶K作用30 min，加入封閉液孵育20 min，滴加生物素標記液，37 ℃避光孵育60 min；滴加Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min；滴加DAB顯色，蘇木素染色1 min，封片，于顯微鏡下觀察神經細胞凋亡情況，采用Image Lab軟件計數。

2.9 血清中BDNF水平及海馬組織中AchE、ChAT活性的檢測

取各組大鼠血清，按ELISA試劑盒說明書測定血清中BDNF水平；取各組大鼠海馬組織，勻漿后，采用比色法測定海馬組織中AChE和ChAT活性。

2.10 Western blotting檢測海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K、Akt、p-Akt和Caspase-3的蛋白表達

取各組大鼠海馬組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在組織研磨儀中研磨，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，加入Loading Buffer，100 ℃煮沸使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封閉1 h，分別加入BDNF抗體（1∶500）、TrkB抗體（1∶5000）、p-TrkB抗體（1∶1000）、PI3K抗體（1∶1000）、Akt抗體（1∶5000）、p-Akt抗體（1∶1000）、Caspase-3抗體（1∶2000）和β-actin抗體（1∶5000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次后，加入二抗（1∶10 000），孵育1 h，TBST洗滌后，加入顯影液，于凝膠成像儀中顯影。

2.11 統計學分析

3 結果

3.1 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠行為學的影響

3.1.1 水迷宮實驗 如圖1-A、B和表1所示，與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長（＜0.01），穿越平臺次數明顯減少（＜0.05），表明經造模后大鼠學習記憶水平下降，產生認知障礙，造模成功；經過藥物干預28 d后，與模型組比較，各給藥組大鼠逃避潛伏期均顯著縮短（＜0.05、0.01），鐵筷子揮發油中、高劑量組和丁苯酞組大鼠穿越平臺次數明顯升高（＜0.05、0.01），表明鐵筷子揮發油可以改善造模大鼠的學習記憶能力。

3.1.2 曠場實驗 如圖1-C和表2所示，與假手術組比較，模型組大鼠跨格次數明顯減少（＜0.01），垂直得分降低（＜0.05）；與模型組比較，鐵筷子揮發油中劑量組和丁苯酞組大鼠跨格次數增加（＜0.05、0.01），表明鐵筷子揮發油可以改善大鼠自主活動性，提高探索能力。

3.1.3 Y迷宮 如圖1-D和表3所示，與假手術組比較，模型組大鼠在新異臂探索時間縮短（＜0.05），但在起始臂的停留時間延長（＜0.05），在其他臂的停留時間無顯著性差異，表明模型組大鼠對新奇事物的探索能力下降；與模型組比較，鐵筷子揮發油中劑量組大鼠在新異臂的探索時間增加（＜0.05），表明鐵筷子揮發油可提高大鼠探索新奇事物的能力。

A-定位航線實驗軌跡圖 B-空間探索實驗軌跡圖 C-曠場實驗活動軌跡三維立體圖 D-Y迷宮活動軌跡三維立體圖，箭頭所指為新異臂

表1 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數的影響(, n = 8)

Table 1 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on escape latency and platform crossing times in rats with CCH-induced VCI (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)逃避潛伏期/s穿越平臺次數/次 給藥前給藥后給藥前給藥后 假手術—29.37±9.3426.63±11.647.13±0.839.25±1.39 模型—101.37±37.73**68.25±18.16**4.75±2.86*5.00±1.41** 鐵筷子揮發油80107.13±24.5030.87±17.60#4.12±1.888.00±3.02## 40106.25±27.2834.00±10.40##4.37±2.137.87±2.47# 20102.25±26.1048.13±24.49#4.62±2.264.75±2.37 丁苯酞63106.75±14.7333.13±12.04##4.50±1.698.75±2.05##

與假手術組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，下表同

*< 0.05**< 0.01sham group;#< 0.05##< 0.01model group, same as below tables

表2 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠跨格次數和垂直得分的影響(, n = 8)

Table 2 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on number of grid crossing and vertical score in rats with CCH induced VCI (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)跨格次數垂直得分 假手術—49.60±12.5313.50±5.26 模型—26.12±9.90**8.12±2.90* 鐵筷子揮發油8026.87±13.076.87±4.15 4051.62±17.88##10.87±5.02 2035.12±17.038.62±2.72 丁苯酞6343.75±10.68#8.12±2.90

3.2 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠大腦皮層及海馬CA1區神經細胞形態的影響

如圖2所示，假手術組大鼠皮層神經元細胞結構完整，類圓形，邊界清晰、可見核仁，海馬CA1區細胞結構排列緊密、整齊；與假手術組比較，模型組大鼠細胞結構變性，有些固縮成梭形、三角形，核仁消失，出現空泡，海馬區神經細胞排列疏松；與模型組比較，鐵筷子揮發油高、中劑量組細胞結構改善，只見少量的細胞固縮，海馬區細胞排列較為整齊，表明鐵筷子揮發油對神經細胞結構的變性有一定的修復作用。

表3 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠新異臂探索時間的影響(, n = 8)

Table 3 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on exploration time of new arm in rats with CCH-induced VCI (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)新異臂探索時間/%起始臂探索時間/%其他臂探索時間/% 假手術—56.32±15.9715.70±9.1227.35±21.78 模型—25.15±11.94*35.40±23.03*23.48±17.21 鐵筷子揮發油8032.50±16.5431.56±19.2825.93±12.64 4049.66±20.92#23.90±10.8426.27±12.70 2022.92±18.1327.30±29.0333.47±29.35 丁苯酞6339.76±27.9839.76±19.6324.02±12.23

箭頭指示神經細胞固縮

3.3 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠大腦皮層及海馬CA1區尼氏小體數量的影響

如圖3和表4所示，假手術組大鼠皮層及海馬CA1區尼氏小體數量豐富，海馬CA1區細胞層數多，尼氏小體間排列緊密、整齊；與假手術組比較，模型組大鼠皮層及海馬中尼氏小體丟失嚴重，海馬CA1區細胞呈散落狀，細胞間距增大，尼氏小體數量明顯減少（＜0.01）；與模型組相比，鐵筷子揮發油高劑量組皮層尼氏小體的數量明顯增加（＜0.05），鐵筷子揮發油高、中劑量組和丁苯酞組海馬CA1區尼氏小體數量明顯增加（＜0.05），且細胞排列較為緊密、有序，表明鐵筷子揮發油可以提高腦組織中尼氏小體的數量，保護神經元細胞。

箭頭指示尼氏小體溶解消失

表4 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠大腦皮層及海馬CA1區尼氏小體數量的影響(, n = 4)

Table 4 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on number of Nissl bodies in cerebral cortex and hippocampal CA1 region in rats with CCH-induced VCI (, n = 4)

組別劑量/(mg·kg?1)尼氏小體數量 海馬CA1區皮層 假手術—90.75±5.37195.00±16.83 模型—44.00±5.35**109.00±10.42** 鐵筷子揮發油8058.00±4.39#156.50±22.64# 4054.50±7.04#117.00±19.88 2039.50±6.61108.00±12.35 丁苯酞6359.25±3.86#120.75±28.06

3.4 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠大腦皮層及海馬CA1區神經細胞凋亡的影響

如圖4和表5所示，與假手術組比較，模型組大鼠皮層及海馬CA1區中凋亡細胞數量明顯增多，細胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，鐵筷子揮發油高、中劑量組和丁苯酞組大鼠皮層及海馬CA1區細胞凋亡率均顯著降低（＜0.05），表明鐵筷子揮發油可以抑制神經細胞凋亡，對神經元細胞具有保護作用。

箭頭指示凋亡細胞

表5 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠大腦皮層及海馬CA1區神經細胞凋亡的影響(, n = 4)

Table 5 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on neuronal apoptosis in cerebral cortex and hippocampal CA1 region in rats with CCH-induced VCI (, n = 4)

組別劑量/(mg·kg?1)細胞凋亡率/% 海馬CA1區皮層 假手術—25.12±4.5030.37±5.85 模型—76.60±9.38**89.10±5.50** 鐵筷子揮發油8040.28±3.10#55.32±4.54# 4054.28±3.02#74.28±9.36# 2080.59±4.0986.42±5.31 丁苯酞6350.67±5.34#65.12±9.97#

3.5 苗藥鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠血清中BDNF水平及海馬組織中AChE、ChAT活性的影響

如表6所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清中BDNF水平和海馬組織中ChAT活性均顯著降低（＜0.05），海馬組織中AChE活性顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，鐵筷子揮發油高劑量組和丁苯酞組大鼠海馬組織中ChAT活性均顯著升高（＜0.05）；鐵筷子揮發油高、中劑量組和丁苯酞組大鼠血清中BDNF水平顯著升高（＜0.05、0.01），海馬組織中AChE活性顯著降低（＜0.05），表明鐵筷子揮發油可以通過提高血清中BDNF水平，調節海馬組織中AChE和ChAT的活性而發揮作用。

表6 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠血清中BDNF水平及海馬組織中AChE、ChAT活性的影響(, n = 8)

Table 6 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on BDNF level in serum and AChE, ChAT activities in hippocampus in rats with CCH-induced VCI (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)BDNF/(pg·mL?1)AChE/(U·mg?1)ChAT/(U·g?1) 假手術—319.20±72.810.373 8±0.057 3122.86±30.01 模型—182.92±52.44*0.538 9±0.135 9**77.73±20.21* 鐵筷子揮發油80267.64±47.42#0.419 5±0.076 1#108.54±35.12# 40301.19±92.58##0.448 4±0.052 6#85.50±26.90 20202.17±58.530.504 4±0.101 680.86±16.71 丁苯酞63264.60±66.01#0.411 9±0.080 8#109.50±26.62#

3.6 鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K、Akt、p-Akt和Caspase-3蛋白表達的影響

如圖5所示，與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01），Caspase-3蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，鐵筷子揮發油高、中劑量組大鼠海馬組織中BDNF和p-TrkB蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）；鐵筷子揮發油高劑量組大鼠海馬組織中TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05）。

4 討論

人口老齡化是世界發展大勢，2018年我國65歲及以上的老年人達到1.67億，占我國總人口數的11.9%，預計2020—2035年中國老年人口將實現大幅增長[17]。CCH高發于中老年人群，當腦缺血發生時，腦灰質和腦白質產生缺血性損傷從而誘發VCI[18]。

A-假手術組 B-模型組 C-鐵筷子揮發油高劑量組 D-鐵筷子揮發油中劑量組 E-鐵筷子揮發油低劑量組 F-丁苯酞組 與假手術組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

目前，常采用BCCAO法制備CCH模型，經BCCAO造模后，大鼠全血黏度中切、低切偏高，血漿黏度增加，出現血液流變學障礙，學習記憶能力受損[19]。大鼠具有Willis循環，與人類腦血管解剖較為接近，雙側頸總動脈結扎后大鼠可通過基底動脈和基底動脈環調節血流，逐漸形成側枝循環所，產生一種慢性腦低灌注狀態。但是一次性阻斷會導致大鼠腦內血流量急性減少，與慢性低灌注的損傷不太吻合，且動物死亡率較高，因此本研究采用改良的BCCAO即間隔1周后結扎另一側頸總動脈的方法制備CCH模型，來探究苗藥鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠的作用及機制。

Morris水迷宮已被廣泛用于評價嚙齒類動物對空間位置感和方向感的學習、記憶能力。水迷宮可利用嚙齒類動物怕水但善于游泳的天性迫使動物學習[20]，本研究共進行2次水迷宮實驗，第1次是通過與假手術組比較，篩選出具有學習、記憶障礙的CCH致VCI大鼠（即具有認知功能障礙的大鼠）；第2次是給藥后對各組大鼠學習記憶能力的檢測，探究鐵筷子揮發油對大鼠的學習記憶能力是否有改善作用，評價其對大鼠認知能力的影響。結果顯示，造模后的大鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數降低，表明CCH可損害大鼠的學習記憶能力，導致VCI的產生；給藥后，與模型組比較，各劑量鐵筷子揮發油均可以縮短大鼠的逃避潛伏期，其中高、中劑量組還可提高大鼠的穿越平臺次數。CCH誘導的VCI不僅體現在學習記憶方面，還有注意力、定向力和執行力方面的障礙[21]，因此本研究還采用了曠場和Y迷宮2種行為學實驗探究苗藥鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠的作用，結果顯示，鐵筷子揮發油可以增加模型大鼠的跨格次數，提高大鼠對新異臂的探索能力。通過上述3種行為學檢測，可以初步看出鐵筷子揮發油可以改善CCH致VCI大鼠的學習記憶能力，提高大鼠探索能力以及提高其對新鮮事物的喜好。

長期的腦灌注不足極易對大腦皮層及海馬產生影響，丁利靜等[22]發現采用BCCAO構建的CCH大鼠皮層及海馬中神經細胞損傷嚴重，發生了細胞結構的變性；牟靜靜[23]發現CCH致認知功能障礙的大鼠中，海馬CA1區和額葉皮質神經元細胞出現大量脫失、組織結構紊亂，神經元細胞大量凋亡脫失。大腦皮層作為最高級的神經中樞，在外界信息的整理和翻譯中發揮著重要的作用，一旦產生損傷會對日常的認知記憶產生影響。同樣，海馬更是記憶儲存的重要場所，其中CA1區對缺血缺氧等損傷最為敏感，CA1區神經元的損傷、缺失也會造成記憶的損壞。HE染色結果表明，模型大鼠神經細胞結構發生改變，核仁消失，有些甚至固縮為梭形和三角形，海馬中的神經細胞較假手術組排列稀疏、紊亂，表明皮層及海馬中的神經細胞受損，也再次確認了CCH致VCI大鼠造模成功，而鐵筷子揮發油可以修復皮層及海馬中神經細胞的損傷。為了進一步探究神經細胞的損傷程度及鐵筷子揮發油對腦組織的保護作用，又采用Nissl染色和TUNEL染色發現鐵筷子揮發油可以抑制模型大鼠皮層及海馬CA1區尼氏小體的減少和神經細胞的凋亡，從而產生神經保護作用。

BDNF主要在神經元和神經膠質中合成，低水平的BDNF與認知功能障礙高度相關，上調BDNF會對許多神經系統疾病產生有益的影響[24-25]。成熟的BDNF在腦內和外周血清中均有分布，其中在海馬及大腦皮層中含量極高，大腦中的BDNF可通過血腦屏障進入外周血清，并與血清中BDNF的變化呈正相關。因此本研究首先通過ELISA法對大鼠血清中BDNF水平進行檢測分析，發現模型組大鼠血清中BDNF水平顯著下降，這也驗證了CCH大鼠VCI產生的原因確與BDNF的減少有關，鐵筷子揮發油可提高大鼠血清中BDNF水平。不僅如此，外源性BDNF還能提高膽堿能樣神經元的功能，增加海馬突觸體釋放乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）[26]。已有研究表明BDNF對中樞膽堿能神經元有刺激生長作用，能促進背根神經節神經元突起向中樞生長，也可延長離體培養胚胎大鼠腦中膈膽堿能神經細胞的存活時間，并增加AChE和ChAT的活性[27]。因此本研究對大鼠海馬組織中AChE、ChAT的活性進行檢測，結果表明模型組大鼠海馬組織中ChAT活性降低，AChE活性升高。ChAT是合成ACh的關鍵酶，AChE可酶解ACh，鐵筷子揮發油可通過提高ChAT活性、降低AChE活性來協調ACh的平衡，改善認知功能的障礙。BDNF作為神經營養因子的一員，可通過一種特定的酪氨酸激酶受體即TrkB，在中樞神經系統（central nervous system，CNS）突觸可塑性的形成和神經元細胞的存活中發揮著有益的作用[28]。通過激動劑或促突觸分子級聯（如蛋白激酶C-BDNF途徑）激活BDNF/TrkB信號，可改善突觸喪失和促進神經再生[29]。BDNF與TrkB結合后還可激活PI3K/Akt信號通路，PI3K/Akt信號通路在抑制神經細胞凋亡和促進神經元存活方面發揮著重要的作用[30-31]，Akt磷酸化后可抑制Caspase，從而抑制細胞凋亡[32]。本研究通過檢測BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達來探究鐵筷子揮發油改善CCH致VCI大鼠的作用機制，結果表明模型組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表達水平較假手術組均顯著降低，Caspase-3作為Caspase級聯反應中最終的執行酶，其表達顯著提高；鐵筷子揮發油高劑量組可顯著提高模型大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表達水平，降低Caspase3蛋白表達水平，表明鐵筷子揮發油的治療機制可能與激活BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號通路有關。

綜上所述，苗藥鐵筷子揮發油對CCH致VCI大鼠的認知功能有改善作用，其作用機制與改善神經細胞結構、提高腦中尼氏小體數量、抑制細胞凋亡、上調血清BDNF水平和海馬組織ChAT活性、降低海馬組織AChE活性有關，此外，還與激活BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號通路有關。CCH作為一種低灌注狀態，其不同時間段檢測的結果也可能不同，因此若能將在不同時間段檢測其相關細胞因子的含量，將為進一步深入研究鐵筷子揮發油的作用機制提供基礎，也為鐵筷子揮發油在腦血管方面的應用提供方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of volatile oil ofon vascular cognitive impairment rats induced by chronic cerebral hypoperfusion

DING Xiao-li1, 2, 3, XUE Ding-jia1, 2, DENG Wan-juan1, 2, HAN Cai-yao1, 2, LIU Xiao-long1, 2, LI Yuan1, QIAN Hai-bing1, 2

1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China 2. Guizhou Provincial Key Laboratory of TCM Prescription and Pharmacology, Guiyang 550025, China 3. Longyan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Longyan 364030, China

To explore the effect and mechanism of volatile oil of Miao medicine Tiekuaizi () on chronic cerebral hypoperfusion (CCH)-induced vascular cognitive impairment (VCI) in rats.CCH model was established by modified bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) method, rats with successful modeling were randomly divided into model group, volatile oil ofhigh-, medium-and low-dose (80, 40, 20 mg/kg) groups and butylphthalide (63 mg/kg) group, and sham operation group was set up. Rats were given corresponding drug for 28 d , water maze test was used to test the learning and memory ability of rats in each group; Open field test and Y-maze test were used to test the autonomous activity and novelty exploration ability of rats in each group; Hematoxylin-eosin (HE) staining, Nissl staining, TUNEL staining were used to observe the changes in structure of nerve cells, Nissl bodies and number of apoptotic cells in cerebral cortex and hippocampus CA1 area of rats in each group; Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) level in serum was detected by ELISA; Colorimetric method was used to detect the activities of acetylcholinesterase (AChE) and cholineacetyltransferase (ChAT) in hippocampus of rats in each group; Western blotting was used to detect BDNF, tyrosine kinase receptor B (TrkB), phosphorylated TrkB (p-TrkB), phosphatidylin-ositol-3-kinase (PI3K), protein Kinase B (Akt), p-Akt and cysteine ??aspartate protease-3 (Caspase-3) protein expressions in hippocampus of rats in each group.Compared with model group, escape latency of rats in volatile oil ofgroup was shortened (< 0.05, 0.01), number of crossing platform and grid crossings were increased (< 0.05, 0.01), time spent in new arm was prolonged (< 0.05, 0.01), degeneration of nerve cell structure was improved, number of Nissl bodies in brain tissue was increased (< 0.05), cell apoptosis was decreased (< 0.05), BDNF level in serum and ChAT activity of in hippocampus were increased (< 0.05, 0.01), AChE activity in hippocampus was decreased (< 0.05), BDNF, TrkB, p-TrkB, PI3K and p-Akt protein expression levels in hippocampus were significantly increased (< 0.05, 0.01), Caspase-3 protein expression level was decreased (< 0.05).Miao medicine volatile oil ofcan improve CCH-induced cognitive impairment in VCI rats, and its mechanism may be related to the activation of BDNF/TrkB/PI3K/Akt signaling pathway.

volatile oil of; chronic cerebral hypoperfusion; vascular cognitive impairment; brain-derived neurotrophic factor; tyrosine kinase receptor B; PI3K/Akt signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)17 - 5389 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.015

2022-04-17

貴州省科技計劃項目（黔科合基礎-ZK[2022]一般471）；貴州省國際科技合作計劃項目（黔科合外G字[2010]7012號）

丁曉麗（1996—），碩士研究生，從事中藥及民族藥的基礎研究與開發。Tel: 18300850421 E-mail: 1285485794@qq.com

錢海兵，博士，教授，從事中藥及民族藥藥效物質基礎及作用研究。Tel: 13984350701 E-mail: 279753407@qq.com

[責任編輯 李亞楠]