奶粉中膽固醇的測定方法驗證

崔承遠

北大荒完達山乳業股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150078

0 引言

膽固醇，別稱膽甾醇，是一種環戊烷多氫菲的衍生物，其廣泛存在于動物體內，尤以腦及神經組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量較高，其溶解性與脂肪類似，不溶于水，易溶于乙醚等溶劑，是動物組織、細胞所不可缺少的重要物質。

膽固醇在人體內有著廣泛的生理作用，但當其過量時便會導致高膽固醇血癥，對機體產生不利的影響。現代研究已發現，動脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與膽石癥、高膽固醇血癥有密切的相關性。如果是單純的膽固醇高，則飲食調節是最好的辦法；若還伴有高血壓等癥狀，則需要同時使用降壓藥物。因此，膽固醇雖然不是嬰幼兒配方奶粉及成人奶粉中的必檢項目，但對于其含量卻同樣需要進行相應的監測。

本檢測方法相比于目前檢測食品中膽固醇所常用的方法——《GB5009.128—2016食品安全國家標準 食品中膽固醇的測定》中第一法氣相色譜法而言，具有操作更便捷，耗時相對更短等優勢，可以在一定程度上提高實驗室工作效率。

1 材料與方法

1.1 試劑

無水乙醇（C2H6O），體積分數為95%，分析純；正己烷（C6H14），色譜純；石油醚，沸程30～60 ℃，分析純，氫氧化鉀（NaOH），分析純；無水硫酸鈉（Na2SO4），分析純；膽固醇標準物質，純度＞99%。

1.2 溶液配制

氫氧化鉀溶液（666.7 g/L）：稱取氫氧化鉀200 g于500 mL燒杯中，用無水乙醇定容。

膽固醇標準物質儲備液（1.0mg/mL）：稱取膽固醇標準物質100 mg（精確至0.1 mg）于100 mL容量瓶中，用正己烷定容，混勻。此為濃度為1.0 mg/mL的膽固醇標準物質儲備液。

膽固醇標準物質中間液（0.010mg/mL）：準確移取1.0 mL膽固醇標準物質儲備液于100 mL容量瓶內，用正己烷定容，混勻。此為濃度為0.010 mg/mL的膽固醇標準物質中間液。

1.3 儀器設備及參數

1.3.1 儀器設備

氣相色譜儀（配置有FID氫火焰離子化檢測器），美國珀金埃爾默公司；電子天平（感量為0.1mg），山東博科科學儀器有限公司；平行濃縮儀，睿科集團股份有限公司；超聲波振蕩儀，昆山潔力美超聲儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器，唐山力辰科技有限公司；分液漏斗（125 mL），天津天玻科技發展有限公司。

1.3.2 氣相色譜儀參數設置

進樣口溫度：300 ℃；檢測器溫度：300 ℃；分流比：10:1；進樣量：1.0 μL；色譜柱：型號DM-35石英毛細管柱，柱長30 m，內徑0.25 mm，膜厚0.25μm；程序升溫：如表1所示；輔助氣體：氫氣45 mL/min、空氣450 mL/min；載氣：高純氮氣1.0 mL/min。

表1 程序升溫條件

2 分析步驟

2.1 試樣處理

2.1.1 試樣皂化

稱取奶粉試樣（不含淀粉）1 g（精確至0.0001 g）于38 mL具四氟乙烯螺紋帽玻璃試管中，先后加入5 mL95%乙醇溶液及10 mL氫氧化鉀溶液，擰緊瓶蓋，將試管置于恒溫磁力攪拌器內以（100±5）℃水浴皂化反應1 h[1]。

2.1.2 組分提取

水浴結束后將樣液冷卻至室溫，以少量水將試管內樣液轉移至125 mL分液漏斗內，加入25 mL石油醚萃取2～3 min[2]。將下層水相轉移至另一只125 mL分液漏斗中，加入25 mL石油醚再次萃取2～3 min。合并兩次提取液，以超純水沖洗提取液直至呈現中性[3]。

2.1.3 濃縮定容

將提取液通過無水硫酸鈉過濾至250 mL雞心瓶內，并以石油醚沖洗分液漏斗及過濾漏斗，將沖洗液與提取液合并，置于旋轉蒸發儀內蒸發濃縮至近干。用正己烷將雞心瓶內樣液轉移至10 mL容量瓶內，以正己烷定容，混勻[4]。此為膽固醇樣液，氣相色譜儀待測[5]。

2.2 標準曲線制作

分別吸取濃度為0.010 mg/mL的膽固醇標準物質中間液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、5.0 mL、10.0 mL和50.0 mL于6 支10 mL容量瓶內，以正己烷定容，混勻，此為濃度分別為0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL及50 μg/mL的膽固醇系列標準物質工作液。

將稀釋好的膽固醇標準系列工作液分別注入到氣相色譜儀中，得到每個濃度的膽固醇標準物質工作液所對應的響應值（峰面積）和圖譜。

以膽固醇響應值（峰面積）為縱坐標，膽固醇的質量為橫坐標繪制膽固醇標準物質曲線，得到膽固醇回歸方程。

2.3 試樣溶液的測定

相同條件下，將樣品溶液分別引入氣相色譜儀進行測定。根據回歸方程計算出樣品中膽固醇的濃度。

2.4 分析結果的表述

試樣中膽固醇含量按式（1）計算：

式中：X-試樣中膽固醇的含量，單位為毫克每千克（mg/100g）；Cs-從標準曲線中得到試樣測定膽固醇的質量含量，單位為毫克（mg）；m-試樣的質量，單位為克（g）；fi-試樣測定液稀釋倍數；100-換算系數。計算結果保留至小數點后一位。

2.5 方法特性參數驗證

2.5.1 線性范圍

稱取膽固醇標準物質0.1000 g，按照膽固醇標準物質溶液曲線方程制作的操作步驟進行操作。分別配制6 個濃度點，每個濃度點平行運行3 次，得到18 個濃度點所對應的響應值（峰面積）[6]。如表2所示。

表2 膽固醇標準物質工作液濃度及響應值（峰面積）對應表

應用上述18 個標準物質工作液所對應的響應值/峰面積及對應的碘質量擬合曲線方程，得到膽固醇標準物質曲線方程為：

膽固醇標準物質曲線圖如圖1所示。從試驗結果可見，標準曲線線性回歸方程相關系數大于0.99，濃度范圍覆蓋關注濃度的0%～150%。

圖1 膽固醇標準物質曲線圖

2.5.2 方法檢出限與定量限

采用空白標準偏差法，選擇脫脂奶粉樣品，稱取10 份，每份稱取1 g，按照標準方法進行試樣預處理，并對最終樣液進行10 倍稀釋，用于膽固醇方法檢出限的測定。并通過氣相色譜分析得出圖譜及各自響應值（峰面積）。

參考《GB 5009.128—2016食品安全國家標準 食品中膽固醇的測定》中第一法氣相色譜法中膽固醇的檢出限0.3 mg/100 g，其對應的檢出濃度為0.3 μg/mL。本方法按照該檢出濃度，以脫脂奶粉作為空白本底試樣，加入適量膽固醇標準物質，使其最終理論濃度0.3 μg/mL。并按照上述2.1進行10 平行試驗，10 次檢測結果及方法檢出限及定量限詳見表3。

由表3得出，膽固醇的方法檢測限（LOD）=0.08 mg/100 g，膽固醇的方法定量限（LOQ）=0.24 mg/100 g。

表3 膽固醇方法檢出限與定量限結果 單位：mg/100g

2.5.3 精密度

選擇成人奶粉樣品，進行10 平行試驗，按照上述所描述的操作步驟進行試樣前處理和測定，并應用上述方法檢出限所應用的標準物質線性方程進行批處理及計算[7]。試驗結果詳見表4。

表4 膽固醇精密度試驗結果

2.5.4 正確度

選擇脫脂奶粉樣品作為本底試樣，分別進行3 水平6 平行加標回收率試驗，即正確度試驗。3 水平加標濃度分別為低濃度、中濃度和高濃度，其中低濃度加標回收率試驗按照上述試驗所得方法檢出限，即0.08 mg/100 g本底含量的0.5倍進行加標，中濃度加標回收率試驗按照本底含量的1.0 倍進行加標，高低濃度加標回收率試驗按照本底含量的1.5 倍進行加標[8]。試樣處理過程按照《GB 5009.128—2016 食品安全國家標準 食品中膽固醇的測定》執行。加標含量及回收率詳見表5。

表5 膽固醇正確度試驗結果

經計算，膽固醇3 水平6 平行共計18 個加標回收率試驗，結果在91.1%～110%之間。

3 結論

經線性范圍、方法檢出限、精密度和正確度方法特性參數的驗證，得出膽固醇的方法檢出限為0.08 mg/100 g，方法定量限為0.24 mg/100 g，精密度為2.03%，3 水平6 平行正確度試驗加標回收率在91.1%～110%范圍內，均滿足《GB/T 27417—2017合格評定 化學分析方法確認和驗證指南附錄A》的要求。