7 味中藥對奶牛乳房炎病原菌的體外抑菌試驗研究

寨鴻瑞，張懂理，郭 慶

1 開封市動物疫病預防控制中心，河南開封 2667002 淮北市烈山區農業農村水利局，安徽淮北 2350003 安徽科寶生物工程有限公司，安徽淮北 235000

0 引言

奶牛乳房炎（Mastitis）是由病原微生物侵入、機械性刺激及化學物理性損傷所致的奶牛乳房實質、間質炎癥的疾病，是奶牛常見疾病之一，給奶牛養殖業造成了巨大的經濟損失，是制約奶業發展的主要疾病。其主要致病因素是傳染性病原微生物，包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌等[1～3]。安徽省奶牛乳房炎的主要致病菌為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，所占比例為72.72%[4]。目前，主要用抗生素防治奶牛乳房炎，存在抗生素殘留和耐藥性等問題[5]，隨著人民生活水平的日益提高，國家對乳制品質量有了更嚴格的標準，臨床治療奶牛乳房炎的抗生素逐步被限用或禁用[6]。中草藥是純天然物質，具有抗菌、消炎、無耐藥性、無殘留等特點，應用中草藥替代抗生素防治奶牛乳房炎[7，8]，已日益成為奶牛場的共識。本試驗采用試管二倍稀釋法，比較7 味中藥對3 種主要致病菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），以篩選出效果好的中藥，為研制治療奶牛乳房炎方劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥

紫錐菊、金銀花、連翹、紫蘇、杜仲葉、黃芪、甘草均為生藥，購于市養生堂大藥房。

1.1.2 試驗菌株

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌從安徽淮北某奶牛場患有隱性乳房炎奶牛的牛奶中分離。

1.1.3 儀器

HH-4數顯恒溫水浴鍋、RE-52旋轉蒸發儀，鄭州長城科工貿有限公司；DL-360B智能超聲波，上海之信儀器有限公司；微量移液器，大龍興創實驗儀器（北京）股份公司；LD4-2低速離心機，上海滬粵明科學儀器有限公司；LDZX-50FBS立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海恒磁電子科技有限公司；H-B11-500型電熱恒溫培養箱，上海新諾儀器集團有限公司；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺，南京萊步科技實業有限公司。

1.1.4 試劑及培養基

食品級無水乙醇，安徽安特食品股份有限公司；牛肉浸膏、蛋白胨、瓊脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨，北京三藥科技開發公司；普通肉湯培養基、普通瓊脂培養基、LB培養基，參照文獻[9]制備。

1.1.5 中藥液的制備

將紫錐菊、金銀花、連翹、紫蘇、杜仲葉、黃芪、甘草分別準確稱取100 g，用75%乙醇浸泡30 min（料液比10∶1），然后超聲15 min，第一次回流提取2 h，用16 層紗布過濾倒出藥液。藥渣再加75%乙醇（料液比8∶1），第二次回流提取1 h，倒出藥液，合并兩次濾液，旋轉蒸發至無醇味至每毫升含1 g生藥，3000 r/min離心10 min，取上清液，121 ℃流通蒸汽滅菌15 min。滅菌后4 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 操作步驟

采用試管二倍稀釋法測定MIC，操作全部在超凈工作臺內進行。

（1）取加塞無菌小試管9 支，每管中加入制好的普通肉湯培養基1 mL，在第1管中加中藥1 mL，用微量移液器混勻，吸取1 mL至第2管混勻，依次到第7管，第8管做陽性對照（加菌液不加中藥），第9管做陰性對照（加中藥不加菌液）。

（2）加稀釋好的菌液0.1 mL，第9管不加菌液。此時1到7號管內藥液的濃度分別相當于500.00 mg/mL、250.00 mg/mL、125.00 mg/mL、62.50 mg/mL、31.25 mg/mL、15.63 mg/mL、7.81 mg/mL生藥濃度，8號管作陽性對照管，9號管作陰性對照管。

（3）將各組試管置37 ℃恒溫培養箱中培養18 h，觀察記錄結果。與對照組比較，有絮狀沉淀的管則為有細菌生長，無絮狀沉淀的管為細菌生長受抑制管，以肉眼觀察無絮狀沉淀管的最低藥物濃度作為該藥MIC。

（4）重復1至3步，試驗結果取3 次試驗的平均值。

1.2.2 結果判斷

由于中藥對細菌的MIC國內目前尚無統一的標準，本試驗參照同類試驗[10]的標準作為判斷標準。

當MIC＜7.81 mg/mL生藥濃度時為高度敏感；當MIC在15.63～62.5 mg/mL生藥濃度時為中度敏感；當MIC為62.5～250.00 mg/mL生藥濃度時為較敏感；當MIC＞250.00 mg/mL生藥濃度時為不敏感。見表1。

表1 不同中藥濃度的藥敏判斷標準

MBC的判斷：測出MIC后，再依次從未見細菌生長的各試管培養物中取一接種環，接種于不含藥的普通瓊脂平板上，輕輕攤開菌液，37 ℃培養24 h，觀察有無細菌生長。在普通瓊脂平板中，生長的菌落數小于5 個菌落的藥液最低濃度，即為MBC。

2 結果

7 味中藥對3 種致病菌的體外抑菌濃度MIC和MBC的測定結果見下表2。從表中可以看出金銀花、紫錐菊、連翹、甘草、紫蘇對金黃色葡萄球菌中度敏感，杜仲葉、黃芪次之；紫錐菊、紫蘇、金銀花對大腸桿菌中度敏感，連翹次之；金銀花和連翹對無乳鏈球菌中度敏感，紫蘇次之。

表2 7 味中藥對3 種致病菌的MIC和MBC 單位：mg/mL

3 討論

本試驗所用菌株直接從患病奶牛乳中分離并鑒定，用中草藥提取物對3 種細菌的抗菌活性進行測定。從本次試驗結果可知，7 味中藥對3 種細菌的MIC和MBC與文獻報道[11～13]相一致。中藥的不同產地，不同季節采收其所含成分不同，不同地方細菌分離菌株和毒力是影響中藥體外抑菌試驗結果的重要因素。

本試驗采用75%乙醇回流提取法提取藥液，回收乙醇并濃縮至每毫升含1 g生藥測定其抑菌效果，金銀花和甘草對金黃色葡萄球菌抑菌效果最強，MIC值均為15.63 mg/mL，MBC值均為31.25 mg/mL；紫錐菊對大腸桿菌的效果最強，MIC值為15.63 mg/mL，MBC值為31.25 mg/mL；金銀花和連翹對無乳鏈球菌抑菌效果最強，MIC值均為31.25 mg/mL，MBC值均為62.5 mg/mL。從本次試驗結果可知，紫錐菊、金銀花、連翹可作為防治奶牛乳房炎制劑的主藥，但與其他藥物之間的配伍作用及其體外藥理作用還需要進一步研究。