生駝乳中金黃色葡萄球菌的分離鑒定與耐藥性分析

歐秀玲，蔡擴軍 ，徐 敏

1 新疆華博檢測技術有限公司，新疆烏魯木齊 8300002 新疆農業大學動物醫學學院，新疆烏魯木齊 8300523 烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 8300634 烏魯木齊市奶業協會，新疆烏魯木齊 830063

0 引言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一種普遍存在于外界環境中的致病菌[1]，既對食品衛生安全及人類健康造成嚴重的威脅[2]，也可引起哺乳動物的乳房炎，使產奶量和奶品質下降[3]。近年來，隨著生駝乳中多種生物學活性物質被不斷發現，駝乳的醫學保健功能得到了人們的認可，駝乳的需求量激增，駱駝養殖數量迅速增加，帶動了駱駝產業的發展。但駝乳與其他動物乳的飲用方式不同，當地牧民一般不經煮沸，而將生駝乳直接發酵成酸駝乳飲用，因此，對生駝乳中致病微生物的研究具有重要的公共衛生學意義。本研究對養殖環節生駝乳中的金黃色葡萄球菌進行分離與鑒定，并對其耐藥性進行分析，為保證生駝乳的質量安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

7.5%氯化鈉肉湯，北京陸橋技術股份有限公司；金黃色葡萄球菌顯色培養基，法國科瑪嘉CHROMagar公司；大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA），美國BD公司；藥敏片，杭州濱和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色液，珠海貝索生物技術有限公司。

1.2 主要儀器

全自動微生物檢定儀（VITEK2）及配套的微生物生化鑒定卡，法國梅里埃公司；生物安全柜，上海力申科學儀器有限公司；顯微鏡，賽默飛世爾科技公司；恒溫搖床（TH2-92B），上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；恒溫培養箱（BPC-250F），上海一恒科學儀器有限公司；電子天平（FA2104N），上海精密科學儀器有限公司。

1.3 金黃色葡萄球菌的分離、鑒定

1.3.1 樣品采集

對駝乳乳頭進行消毒，棄去前三把奶，用無菌采樣袋采集300 mL生駝乳，放入含有冰袋的運輸箱，低溫運輸至實驗室。

1.3.2 檢驗程序

參考《GB 4789.10—2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗》金黃色葡萄球菌檢驗制定檢驗程序[4]。具體見圖1。

圖1 金黃色葡萄球菌檢驗程序

1.3.3 操作步驟

（1）樣品的處理及增菌

量取25 mL生駝乳于225 mL 7.5%氯化鈉肉湯中，振蕩混勻，（36±1）℃恒溫培養箱中培養18 ～24 h。

（2）分離

用無菌接種環取培養好的增菌液，連續劃線接種于科馬嘉金黃色葡萄球菌顯色培養基，并觀察菌落生長、形態、顯色情況。

（3）純化

從金黃色葡萄球菌顯色培養基上輕輕挑取一個目標菌落，再次劃線接種于大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）平板上進行純化。

（4）革蘭氏染色鏡檢

從大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）平板上挑取疑似菌落涂片固定，按照革蘭氏染色液試劑盒說明書中初染、媒染、脫色、復染等四個步驟進行革蘭氏染色，并用顯微鏡鏡檢。

（5）全自動微生物鑒定儀進行生化鑒定

根據革蘭氏染色情況，挑取TSA平板上的疑似菌落，選擇革蘭氏陽性細菌鑒定卡，用VITEK-2全自動微生物鑒定儀進行鑒定。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌的分離、鑒定

2.1.1 顯色培養基上菌落顏色及形態

金黃色葡萄球菌在科馬嘉金黃色葡萄球菌顯色培養基上呈現粉紅色光滑菌落，如圖2。

圖2 金黃色葡萄球菌在顯色培養基上的菌落形態

2.1.2 革蘭氏染色鏡檢

從平板上挑取疑似菌落進行革蘭氏染色，染色結果顯示，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，顯微鏡下呈葡萄狀排列，無芽胞，無莢膜，直徑為0.5 ～1.0 μm（4×100 倍，圖3）。

圖3 金黃色葡萄球菌鏡檢

2.1.3 VITEK-2全自動微生物鑒定儀進行生化鑒定

利用VITEK-2全自動微生物鑒定儀對可疑菌落進行鑒定，結果顯示，共鑒定出的8 株陽性金黃色葡萄球菌；生化結果顯示：分離陽性菌株對精氨酸雙水解酶1、β-D-半乳糖苷酶、磷酸酶、焦谷氨酸芳胺酶、多粘菌素B耐受、D-半乳糖、L-乳酸鹽等生化反應呈陽性，對磷脂酰磷脂酶C、D-木糖、α-葡萄糖苷酶、環式胡精、α-甘露糖苷酶等生化反應呈陰性（表1）。

表1 金黃色葡萄球菌全自動微生物鑒定儀生化鑒定結果

2.2 藥敏試驗結果

對分離的8 株金黃色葡萄球菌菌株利用紙片擴散法進行藥敏試驗，結果顯示，8 株菌株對青霉素耐藥率達75%；對氧氟沙星敏感率最高，可達100%；對頭孢哌酮鈉、環丙沙星敏感性較高，敏感率可達87.5%；對鏈霉素、卡那霉素、阿莫西林、頭孢唑啉和頭孢西丁，四環素、氯霉素、頭孢噻肟、林可霉素、苯唑西林、慶大霉素較敏感，敏感率在37.5 %～75.0 %之間。見表2。

表2 金黃色葡萄球菌的藥敏試驗

3 討論和結論

駝乳被譽為“沙漠白金”，具有獨特的營養價值和功能。目前對駝乳的研究主要集中于其功能的研究和其有益菌的分離與鑒定。蔡瑞麗[5]和王瑞[6]的研究中均發現駝乳可防治2型糖尿病；徐德洲等[7]的研究發現，駝乳還對急性酒精肝損傷有一定的防治功效；努爾古麗·熱合曼[8]從酸駝乳中可分離出優勢的乳酸菌株；任冬艷等[9]利用常規分離結合16s rRNA測序技術也分離和鑒定出駝乳中的乳酸桿菌菌株。

金黃色葡萄球菌是引起駱駝乳房炎的主要病原菌之一，危害駱駝健康，降低駝乳的產量和品質[10]。本研究對駝乳中分離的金黃色葡萄球菌進行耐藥性分析發現，與牛乳中分離的金黃色葡萄球菌相比，其耐藥性較低，可能與駱駝平時很少用藥有關[11]。藥敏試驗表明，青霉素耐藥率最高，氧氟沙星、環丙沙星、頭孢哌酮鈉、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢噻肟敏感性較高，可用于本地區由金黃色葡萄球菌引起駱駝乳房炎的治療。