糖尿病視網膜病變患者血漿中miR-155的表達水平及臨床意義

趙月娥 俞頌平 曲春生 張旭穎

糖尿病性視網膜病變（Diabetic Retinopathy，DR）是糖尿病的一種神經退行性并發癥，且預后較差［1］。高血糖觸發激活炎癥和氧化應激的生化途徑，從而導致血視網膜屏障破壞，周細胞丟失，神經元死亡和血管生成［2］。MicroRNAs（miRNA）是小分子非編碼RNA，主要通過誘導mRNA降解和抑制靶基因的翻譯來調節基因表達［3］。MiR-155參與調控先天性和適應性免疫，在多種類型的免疫細胞中表達，對細胞增殖，細胞分化和效應器反應（如細胞因子和抗體產生）有正向調控作用［4］。MiR-155的表達失調與慢性炎癥、神經變性和新血管形成等病理狀態有關。但miR-155在DR中的機制作用尚未明確，較少研究評價miR-155在DR人群中的循環水平［5］。本文探討miR-155與DR的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年6月至2020年9月本院糖尿病患者177例，根據視網膜疾病嚴重程度分為：無并發癥患者51例（NDR組），非增殖性糖尿病性視網膜病變患者61例（NPDR組），增殖性糖尿病性視網膜病變患者65例（PDR組）；另收集健康志愿者89例為健康對照。排除患有嚴重白內障或其他眼底疾病。

1.2 試劑與耗材 預先設計的cel-miR-39-3p（20096073）和hsa-miR-155（20058552）的特異性引物和探針、TaqMan? MicroRNA 逆轉錄試劑盒、TaqMan? Universal預 混 液（1905056）、0.2 mL 96孔PCR板（C9N01YN5）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。miRNeasy Serum/Plasma 試劑盒（160041017）購自于德國Qiagen公司。10μL（27818294）、200μL（05919001）吸頭購自美國Axgen公司。

1.3 儀器 ABI 7500熒光定量PCR儀、ABI ProFlex擴增儀（美國 Thermo Fisher），高速冷凍離心機（德國Sigama），P10/P200/P1000 移液槍（德國 Eppendorf）。

1.4 血液樣本采集 采集研究對象靜脈血約3 mL，采集樣本在3 h內送至實驗室，在4℃條件下1,000 g離心15 min，分離血漿和血細胞。血漿樣本分裝后保存在-70℃下，用于miRNA的提取。

1.5 miRNA分離和定量 使用mirRNA提取試劑盒從495μL血漿中提取miRNA，并利用TaqMan?microRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，具體步驟：將10 ng提取的RNA加入15 μL的總反應體系中，在PCR擴增儀上進逆轉錄反應，反應條件為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。使用預先設計的cel-miR-39-3p和hsamiR-155-5p的特異性引物和探針2μL，上述合成的cDNA反應混合物0.5μL，TaqMan?Universal Master Mix II預混液10 μL，RNase-free H2O 7.5 μL，共20 μL的擴增反應體系進行進行定量檢測，反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共45個循環。以外源性cel-miR-39作為參考基因控制miRNA提取和定量過程中的標準化。以一組cDNA樣本為參考樣本，采用比較法（2-△△Ct）［6］測定血漿中miR-155的水平。為了進行統計分析，對倍數變化值進行Log2轉換。

1.6 統計學方法 采用 SPSS 18.0統計軟件。計數資料以（±s）表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗；計數資料以%表示，用χ2檢驗，多因素分析采用Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本資料比較 NPDR組、PDR組胰島素使用比例明顯低于NDR組，差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組甘油三酯（TG）低于NDR組、NPDR組、PDR組；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平明顯高于NDR組、NPDR組、PDR組；且PDR組HDL-C水平明顯低NDR組和NPDR組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。NDR組、NPDR組、PDR組糖化血紅蛋白（HbAlc）水平均高于對照組，且PDR組HbAlc水平高于NDR組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組基礎資料比較

2.2 各組血漿miR-155水平 對照組血漿miR-155水平明顯高于NDR組、NPDR組、PDR組（P＜0.05），且NDR組血漿miR-155水平明顯高于PDR組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組血漿miR-155水平比較

2.3 不同因素對DR嚴重程度影響的多因素Logistic回歸分析 HbAlc是DR發生的危險因素（P＜0.05），即HbAlc每上升一個單位，DR嚴重程度增加2.33倍。而miR-155、HDL-C是DR發生的保護因素（P＜0.05）。見表3。

表3 不同因素對DR嚴重程度影響的多因素Logistic回歸分析

3 討論

在我國，隨著老齡化社會進程的不斷加劇，DR已經是導致中老年人視物模糊、視力下降、甚至失明的主要視網膜疾病。DR發生率與糖尿病病程呈正相關，5年內的糖尿病患者視網膜病變發生率可達40%，而病程＞15年的患者DR發生率近80%［7］。與DR發生相關的miRNA有很多，如miR-15、miR29a、miR29c、miR31、miR126、miR351等［8］。本資料顯示，NDR組、NPDR組、PDR組血漿中miR-155表達均低于對照組，且隨著DR嚴重程度的加劇，miR-155表達水平逐漸減低，這與相關研究［9-10］一致。在轉基因小鼠中，miR-155過度表達導致低血糖、改善糖耐量和增強外周組織的胰島素敏感性，這至少部分是由增強的葡萄糖攝取和糖酵解引起的，而miR-155缺乏則導致相反的效果［10］。但由于缺乏實驗證據表明miR-155對糖尿病患者視網膜功能的影響，很難確定miR-155在DR中的表達與預期的關系。

采用多因素Logistic回歸分析發現，HbAlc是DR發生的危險因素，與胡亞耘等［11］研究結果基本一致。HbAlc水平是評估糖尿病的重要指標，隨著HbAlc水平升高，糖尿病患者發生視網膜微血管病變的風險增加［12］，并與DR病變程度呈正相關。HDL作為運載周圍組織中的膽固醇的關鍵蛋白，是DR的保護因素。TAN等［13］研究認為，高水平HDL可以降低糖尿病患者發生DR的風險，與本資料結果相一致。miR-155與保護性免疫有關，其可以通過調節TLR介導的NF-κB活化來限制炎性細胞因子的產生［14］。盡管目前還無miRNA-155參與DR發病的分子機制研究，但在STZ誘導的糖尿病視網膜病變大鼠模型中，NF-κB信號通路的活化和炎癥因子的產生已被證實的［15］。這提示，高水平的miRNA-155可能通過抑制NF-κB信號通路的活化來避免DR的發生。

綜上所述，miR155在DR患者血漿中表達降低，與患者視網膜病變程度呈正相關，有作為DR早期診斷的生物學標志物的可能性，對DR臨床治療也具有一定指導意義。但miR-155在DR發生及進展過程中的分子作用機制仍需進一步深入研究。