維生素D對小鼠結核感染后獲得性免疫的影響

翁芳芳 余建平 徐凱進

結核病是一種嚴重威脅人類健康的傳染病。我國是結核病大國，是全球22個結核病高負擔國家之一，同時也是全球27個耐多藥結核病流行嚴重的國家之一［1］。文獻報道維生素D的缺乏與結核病的發生可能有所關聯［2］，維生素D補充劑可在高危人群中幫助人們抵抗結核病，其機制可能與先天免疫和獲得性細胞的動態變化相關［3］。本研究探討維生素D對小鼠結核感染獲得性免疫細胞的影響，并通過檢測T細胞因子水平探究其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 （1）BALB/c小鼠：5~6周齡SPF級BALB/c雄性小鼠，共60只，由本院實驗動物中心提供和飼養。所涉及的動物實驗操作由本院實驗動物倫理委員會批準。（2）H37Ra標準菌株：該菌株購于上?？道噬锟萍加邢薰?。菌株在羅氏培養基固定培養，其培養條件為37℃，恒溫保濕。培養20 d后，無菌刮取培養基上生長旺盛呈菜花樣的菌落進行研磨，用0.9%氯化納溶液配制成20 mL菌懸液，其濃度為5×106CFU/mL［4］。（3）藥品與試劑：Vitamin D3（740551，1 mL），Mouse IFN-γ ELISA Kit（RAB0225），Mouse IL-4 ELISA Kit（RAB0300），Mouse IL-17 ELISA Kit（RAB0263）購于sigma公司，Mouse TGF-β 1 ELISA KIT（SEKM-0035）購于Solarbio公司，PE Anti-CD3（ab22268，50 test），APC Anti-CD8（ab237368，100ul），FITC Anti-CD4（ab59474，50 test）購于Abcam公司。（4）儀器設備：BD FACS Calibur流式細胞儀（美國），MD pectraMax190酶標儀（美國）。

1.2 實驗方法 （1）小鼠分組及飼養條件：60只5~6周齡雄性小鼠于SPF級鼠房飼養，飼養條件為18~28℃，日溫差≤3℃，相對濕度40%~70%。適應性飼養1周后，隨機分為3組，分別為對照組、感染組和維生素D干預組，每組各20只。（2）結核感染及干預方式：感染組和維生素D干預組的小鼠通過尾靜脈注射H37Ra菌株，注射劑量為1.0×106CFU/0.2 mL，對照組注射等量0.9%氯化納溶液［4］。維生素D干預組當天肌肉注射維生素D，7 μg/kg，1次/3 d，連續8周，對照組和感染組注射等量0.9%氯化納溶液。按照小鼠建模及實驗原則，進行H37Ra結核菌株培養的明場圖，以確定菌株培養的準確性；各組小鼠接種結核菌株后，解剖小鼠的肺組織病理宏觀圖及微觀圖，以確定造模的成功。（3）流式細胞檢測：小鼠眼眶取血后，進行紅細胞裂解，1,500 r/min離心5 min，PBS重懸外周血單核細胞（peripheral Mononuclear Blood Cell，PBMC），將配好的CD3、CD4、CD8混合抗體加入1.0×106細胞中，4℃避光孵育30 min，2 mL PBS清洗后，流式細胞術檢測細胞亞型及細胞比例［5］。（4）ELISA檢測血漿細胞因子：使用小鼠IFN-γ、IL-14 、IL-17及TGF-β ELISA檢測試劑盒，檢測血清樣本中 IFN-γ、IL-14 、IL-17及TGF-β含量水平，每組設置3個復孔，操作步驟嚴格按照說明書進行［5］。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，計數資料以（n）表示，采用檢驗；實驗獨立重復3次，采用雙尾獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 維生素D干預對小鼠感染后主要臟器質量的影響 感染組與維生素D干預組小鼠脾臟、肺、腎臟、肝臟質量均與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），且感染組與維生素D干預組各器官質量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 維生素D對結核感染小鼠主要臟器質量的影響［g，（±s）］

表1 維生素D對結核感染小鼠主要臟器質量的影響［g，（±s）］

對照組 感染組 維生素D干預組體重 22.21±2.11 22.19±3.2 21.97±1.97脾臟 0.0061±0.0001 0.0060±0.0011 0.0060±0.0009腎臟 0.011±0.001 0.012±0.007 0.012±0.001肺0.0053±0.0005 0.0058±0.0015 0.0054±0.0007肝臟 0.042±0.0035 0.041±0.0025 0.041±0.0027

2.2 維生素D對結核感染小鼠外周血T細胞亞群影響 與對照組比較，感染組和維生素D干預組CD3+T細胞比例增加（P＜0.01），CD4+T細胞比例增加（P＜0.001），CD8+T細胞降低（P＜0.01），CD4+/CD8+T細胞比例升高（P＜0.01），維生素D干預組CD4+/CD8+T細胞比例與感染組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 維生素D對結核感染小鼠T細胞亞群的影響（±s）

表2 維生素D對結核感染小鼠T細胞亞群的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01，**P＜0.001；與感染組比較，#P＜0.05

指標 對照組 感染組 維生素D干預組CD3+ T 54.3±1.69 64.27±1.69* 65.31±2.17*CD4+ T 40.33±1.24 55.9±2.82** 56.3±1.72**CD8+ T 14.2±2.82 11.1±1.41* 10.9±3.21*CD4+ /CD8+ T 3.11±0.18 5.04±0.31* 5.13±0.26*#

2.3 維生素D對結核感染小鼠外周血Th1、Th2、Th17及Treg細胞因子的影響 與對照組比較，維生素D干預組和感染組小鼠均出現IFN-γ、IL-17及TGF-β增加，IL-4降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。維生素D干預組小鼠各細胞因子表達水平比感染組小鼠高，且IFN-γ表達水平差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 維生素D對結核感染小鼠外周血T細胞因子的影響（±s）

表3 維生素D對結核感染小鼠外周血T細胞因子的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01，**P＜0.001；與感染組比較，#P＜0.01

指標 對照組 感染組 維生素D干預組IFN-γ 28.26±11.45 61.57±20.19** 75.31± 2.17**#IL-4 19.34±8.67 14.15±12.01** 13.9±1.72**Il-17 17.16±7.24 21.49±10.34** 20.91±3.21**TGF-β 12.04±4.91 18.48±6.65* 19.13±0.26*

3 討論

自2007年以來，結核病一直位居單一傳染病死因之首，甚至高于人們熟知的艾滋病，是全球前十位死因之一［1］。韓俊鋒等［6］證實肺結核患者血清中維生素D水平低于正常人群，維生素D缺乏與肺結核的嚴重程度相關，同時增加肺結核的傳染性及患病風險，使活動性肺結核治療的療程延長和痰轉陰時間延長。

近年來，維生素D在先天性免疫和獲得性免疫系統的研究逐漸被重視［7］，維生素D與其受體結合后，會促使獲得性免疫細胞釋放IFN-γ，IFN-γ進一步激活先天免疫細胞巨噬細胞來吞噬結核菌，且巨噬細胞會釋放一種陽離子細胞殺傷肽（LL-37），進一步抵抗結核菌的毒性作用［8］。維生素D的缺乏也被證實與肺部的多種疾病相關，包括肺結核疾病、急性肺損傷、哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化等［9］。但GANMAA等［10］提出補充維生素D并未顯著預防結核病感染風險，因此維生素D的作用存在爭議。

維生素D在體內多種酶的作用下轉變為1，25-二羥維生素D3，而通過巨噬細胞和樹突狀細胞呈遞的1，25-二羥維生素D3可介導T細胞對維生素D產生反應，導致炎癥性Th1和Th17細胞的抑制，同時誘導免疫耐T調節（Treg）反應［7］。本研究結果表明，維生素D干預組均出現CD3+T，CD4+T細胞比例及CD4+/CD8+比值增加，CD8+T細胞降低，提示維生素D可以進一步免疫調節。

Th1細胞主要介導細胞免疫，通過巨噬細胞殺滅組織內的病毒、細菌等，Th2細胞與超敏變態反應，如過敏性皮炎、過敏性哮喘等密切相關［11］。本研究顯示，維生素D干預組和感染組小鼠出現IFN-γ、IL-17及TGF-β升高，IL-4降低，同時維生素D干預組小鼠IFN-γ表達水高于感染組，提示免疫應答以Th1細胞為主。一項研究［12］指出在利用卡介苗導致小鼠結核感染的模型中，維生素D添加組與缺乏組相比，維生素D缺乏會影響結核感染小鼠的免疫能力，導致CD4+T細胞及CD8+T細胞下降，CD4+/CD8+比值上升，IFN-γ下降，IL-10上升。表明與免疫損傷密切相關的CD4+/CD8+比值與結核易感程度呈負相關，而IFN-γ與本研究結果相反，這可能需要更多的研究去證實。