腸道菌群多樣性變化與手足口病相關性的分析

林先耀 趙仕勇* 陳海哨 宋聞 滕淑 祁正紅

近10年，手足口病仍是我國兒童發病率及病死率最高的丙類傳染病，嚴重影響兒童健康［1-2］。越來越多的研究報道關于疾病與腸道微生態失衡的關系，也稱為腸道微生態失調［3-4］。腸道微生物群落與營養物質消化吸收、免疫調節應答，具有高度的相關性［5］。然而，關于手足口病患兒腸道菌群結構的變異性和多樣性的報道較少。本文探討手足口病患兒腸道菌群的變異性和多樣性，分析腸道菌群與手足口病的相關性?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月至12月本院經實時熒光聚合酶鏈反應（RT-PCR）法進行病毒核酸檢測及分型，實驗室確診腸道病毒感染的手足口病患兒37例，其中15例為普通手足口病（common HFMD patients，HD）、22例為重癥手足口?。℉FMD patients with encephalitis，HE），另收集同期20例本院體檢健康兒童（normal children's，NC）的糞便標本。根據衛生部頒布的《手足口病診療指南（2010年版）》臨床分類標準［6］。入組標準：①近1月內無使用抗生素、益生菌或益生元等制品；②近1月內無腹瀉、腸道感染等腸道疾病。本項目經本院倫理委員會批準，患兒及健康兒童家長均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）標本采集及資料收集：收集相關臨床資料。糞便樣本采用一次性無菌杯收集，密封后冷鏈1 h內運送至實驗室-80℃ 冰箱，備用；待收集一定量樣本后于冷鏈條件下送至基因公司進行腸道菌群檢測。（2）腸道菌群總DNA提?。簠⒄赵噭┱f明書步驟，使用Power Soil?DNA分離試劑盒（MOBIO，美國）從糞便樣品中提取菌群總DNA。在1%瓊脂糖凝膠上檢測DNA濃度和純度。根據濃度，用滅菌用水稀釋DNA至1 ng/μL，備用。（3）16S rDNA擴增及測序：對微生物基因組16S rDNA V3V4高變行擴增，引物為F341（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和R806（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。所有PCR反應均使用Phusion?高保真PCR預混液（new england biolabs，英國）進行處理。每個樣品用30μL反應體系擴增三份，該反應體系包含15μL Phusion預混液（2×）、3μL引物（2 μm最終濃度）、10 μL基因組DNA（1 ng/μL）和2 μL MOBIO PCR液。擴增條件為：98℃變性30次10 s，50℃退火30 s，72℃延長30 s，72℃延長5 min，將相同體積的1×緩沖液（含SYB-green）與PCR產物混合，在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。選擇主帶亮度在400~450 bp之間的樣品進行下一步實驗。PCR產物以等密度比混合，用Qiagen Gel Extraction Kit（Qiagen，德國）試劑盒對混合PCR產物進行純化，使用Truseq?DNA無PCR樣品制備試劑盒（Illumina公司，美國），并根據廠商的建議生成測序庫、添加索引代碼。文庫質量通過Qubit@2.0熒光計（Thermo Scientific）和安捷倫生物分析儀2100系統進行評估。最后由杭州市中翰金諾醫學檢驗所有限公司采用Illumina HiSeq 2500測序儀（Illumina公司，美國）進行測序。

1.3 統計學方法 檢測樣本共產生5,806個操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），其中98.7%屬于門級。為了規范化每個樣本的測序深度，隨機選擇3,100個序列進行進一步分析。采用QIIME方法計算多樣性指數，包括Shannon指數、觀察物種和系統發育多樣性。采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA）。選擇優勢菌科（至少在一個樣本中相對豐度＞1%）進行細菌分類，并用最小判別分析（LDA）確定腸道菌群的顯著性。采用在線網站工具（http：//enterotypes.org）完成細菌腸型的屬水平分類計算。采用基于距離加權UniFrac的主坐標分析法（PCoA）評價腸道菌群結構的差異，采用mantel檢驗對細菌β多樣性進行顯著性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組臨床表現的相關性分析 手足口病患者咽峽部、手足部和臀部伴有不同程度的皰疹，且部分還伴有嘔吐、發熱、驚厥等癥狀，見表1。37例手足口病患兒病毒核酸檢測結果顯示：人腸道病毒71 型（EV-A71）22例（59.5%），均為HE；柯薩奇病毒A16型（CVA16）2例（5.4%），其它腸道病毒13例（35.1%），均為HD。HE組患者糞便病毒載量、腦脊液細胞數、腦脊液蛋白和白細胞計數均高于HD組，見表2。

表1 三組臨床表現的相關性分析（n）

表2 HD組與HE組臨床指標比較（±s）

表2 HD組與HE組臨床指標比較（±s）

指標 HD組 HE組 F值 P值發熱時間（d） 3.75±1.73 4.43±1.03 87.678 ＜0.001糞便病毒載量 2.13×105 2.03×105 4.864 0.012母乳喂養時間（個月） 7.06±5.21 8.68±4.70 0.187 0.668腦脊液細胞數（個） 120.45±133.00 3.50±1.58 11.492 0.002腦脊液蛋白（g/L） 340.90±148.59 237.25±34.31 6.985 0.012血白細胞計數 10.29±3.29 7.59±3.16 6.279 0.017 C-反應蛋白 5.59±13.92 7.03±10.56 0.115 0.736

2.2 細菌群落α多樣性分析 NC組shannon指數明顯高于HD組（P＜0.05），而HE組shannon指數與HD組差異無統計學意義（P＞0.05）。而觀察物種、系統發育多樣性三組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。腸道菌群shannon指數與發熱天數、咽峽部皰疹、手足臀部皰疹、糞便病毒載量和血液病毒抗體陽性呈相關性（P＜0.05），見表3。

表3 腸道細菌α多樣性與各因素的相關系數

2.3 細菌群落的分類群分布 優勢科（平均相對豐度＞1%）為雙歧桿菌科（15.0%，放線菌門）、科氏菌科（1.4%，放線菌門）、類桿菌科（20.6%，擬桿菌門）、卟啉單胞菌科（2.1%，擬桿菌門）、腸桿菌科（14.6%，變形菌門）、巴氏桿菌科（1.3%，變形菌門）、 疣狀桿菌科（1.1%，疣微菌門）、毛螺旋菌科（14.0%，厚壁菌門）、瘤球菌科（13.7%，厚壁菌門）、丹毒桿菌科（3.7%，厚壁菌門）、梭菌科（2.6%，厚壁菌門）、鏈球菌科（2.1%，厚壁菌門）、維管菌科（1.1%，厚壁菌門），占細菌總序列的 93.25%。單因素方差分析顯示，NC組中雙歧桿菌科的相對豐度顯著降低，而瘤球菌 科、梭狀芽孢桿菌科的相對豐度則顯著升高，HD組中鏈球菌科的相對豐度高于HE（P＜0.05），見表4。瘤球菌科、梭狀芽孢桿菌科和鏈球菌科的相對豐度與發熱天數、咽峽部皰疹、手足臀部皰疹、糞便病毒載量和血液病毒抗體陽性顯著相關，此外，雙歧桿菌科的相對豐度與母乳喂養時間顯著相關（P＜0.05），瘤球菌科相對豐度與驚跳顯著相關，梭菌科的相對豐度與嘔吐、驚跳和肢體抖動顯著相關（P＜0.05），見表5。在屬級，最小判別分析（LDA）揭示優勢菌屬和三個群之間的關系，即糞桿菌屬、羅斯氏菌屬、糞球菌屬、布氏桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬（厚壁菌門），以及NC中的梭狀芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬（厚壁菌門），氣味桿菌屬（擬桿菌門），HD中的雙歧桿菌（放線桿門）、嗜血桿菌（變形菌門）和HE中的厭氧桿菌、假分枝桿菌和真桿菌（厚壁菌門）、普雷沃桿菌（擬桿菌門）。所有樣本可分為三種腸型：ET-P、ET-F和ET-B。僅3例兒童腸道菌群屬于ET-P腸型，24例兒童腸道菌群屬于ET-F腸型，30例屬于ET-B腸型，見表6。

表4 細菌相對豐度的單因素方差分析（±s）

表4 細菌相對豐度的單因素方差分析（±s）

分類 NC組 HD組 HE組 F值 P值擬桿菌科 0.215±0.162 0.192±0.162 0.211±0.163 0.090 0.914雙歧桿菌科 0.037±0.039 0.257±0.039 0.155±0.137 10.068 ＜0.001腸桿菌科 0.154±0.143 0.140±0.143 0.146±0.162 0.030 0.970毛螺菌科 0.156±0.098 0.120±0.098 0.144±0.125 0.484 0.619瘤胃球菌科 0.216±0.170 0.075±0.170 0.118±0.132 5.184 0.009消化鏈球菌科 0.027±0.030 0.017±0.030 0.066±0.113 2.437 0.097梭狀芽孢桿菌科 0.057±0.058 0.011±0.058 0.009±0.005 12.026 ＜0.001紫單孢菌科 0.009±0.007 0.042±0.007 0.012±0.017 1.154 0.323鏈球菌科 0.020±0.035 0.035±0.035 0.008±0.007 2.814 0.069紅蝽菌科 0.012±0.016 0.010±0.016 0.021±0.034 1.120 0.334巴斯德氏菌科 0.013±0.035 0.024±0.035 0.002±0.004 0.992 0.377疣微菌科 0.008±0.025 0.022±0.025 0.004±0.008 0.775 0.466韋榮氏球菌科 0.007±0.011 0.010±0.011 0.017±0.027 1.437 0.246

表5 臨床特征與細菌相對豐度的相關性

表6 不同類型腸道菌群的相關性

2.4 細菌群落結構 HD組和 HE組腸道菌群相似，NC組腸道菌群與HD組和HE組不同。見圖1。

圖1 微生物群落主坐標分析（PCoA）

3 討論

微生物群多樣性受年齡、環境、遺傳學、飲食的影響，微生物群多樣性低與易受各種疾病影響有關，包括對病原菌的抵抗力降低［7］。EV-A71是兒童手足口病的主要病原體，可通過傳感器接合機制改變血液和腸道環境［8］，如血管過敏和炎癥。生態選擇的作用允許適合環境生長的微生物繁殖和不適宜微生物的豐度下降［9］，從而導致微生物相對豐度的變化。HE組微生物群落的不平衡導致Shannon指數下降，而群落的抵抗力和恢復力在一定程度上造成這種不平衡［10］，導致觀察到的物種和系統發育多樣性無明顯變化。

學齡前兒童腸道菌群組成隨年齡變化而變化，新生兒腸道菌群以腸球菌科、鏈球菌科、乳桿菌科、梭狀芽孢桿菌科、雙歧桿菌科為主［11］，斷奶和/或固體食物引起類桿菌、梭狀芽孢桿菌、瘤胃球菌的數量增加，和雙歧桿菌和腸桿菌科的數量減少［12］，然后逐漸演變成富含瘤胃球菌科、毛螺菌科、類桿菌科和普雷沃桿菌科的類似成人樣腸道菌群結構［13］。雙歧桿菌是一種常見的益生菌，可以通過競爭性抑制有害細菌維持腸道健康［14］。雙歧桿菌與EV-A71的關系尚不清楚。母乳和乳制品的攝入可以增加雙歧桿菌的豐度［15］，這可能解釋HD組和HE組雙歧桿菌的相對豐度與母乳喂養時間呈正相關，NC組雙歧桿菌含量低于HD組，HE組可能與母乳喂養時間以及與他們的飲食習慣有關。瘤胃球菌與腸道健康有關［16］，普氏棲糞桿菌曾被報道通過丁酸作為結腸細胞的首選能源以及對細胞凋亡、炎癥和氧化應激的多重影響，在腸黏膜中發揮有益作用，此外，在克羅恩病中，當宿主免疫能力降低，腸道功能紊亂時，普氏棲糞桿菌的相對豐度降低［17］。EV-A71病毒在血液和腸道的侵襲使宿主功能紊亂，這就解釋了手足口病患者瘤胃球菌數量顯著減少的原因。至于梭狀芽孢桿菌科、羅斯氏菌科的豐度可能與體重下降有關［18］，糞球菌可能是兒童腸道健康的潛在生物標志物，布勞特氏菌也與宿主的生理狀態有關，因此，作者推測手足口病患者食欲下降和疾病易感性與梭菌科減少有重要關系。

篩選指示菌并監測其絕對豐度有助于手足口病的臨床診斷和治療。HD組占優勢的細菌屬，紫單孢菌科，非典型病原體，通常是互為影響且對人類有益的，但其有時可能導致疾病，如在某些條件下的人類腹部膿腫［19］。HD組另一個優勢菌屬是流感嗜血桿菌屬。據報道，流感嗜血桿菌是機會性病原體，通常生活在宿主體內而不致病，只有當其他因素（如病毒感染、免疫功能下降或慢性炎癥、過敏等）下才會引起疾病。流感嗜血桿菌通過三聚體自轉運粘附素粘附在宿主細胞上，感染宿主并導致幼兒敗血癥和細菌性腦膜炎［20］。HE組厭氧菌、假分枝桿菌、真桿菌和普雷沃菌是優勢菌屬，厭氧菌是常見的腸道共生菌［21］。普雷沃菌在成人腸道中含量豐富，在高纖維膳食兒童腸道中含量豐富。半乳假分枝桿菌是一種易導致牙髓病的病原體，可導致不同形式的根周?。?2］。腸型有助于疾病狀態的識別，可作為風險或易感性的指標，是疾病進展過程中發生變化的有用生物標志物，具有潛在的臨床應用價值［23］。而本資料中，57個樣本是ET-B型和ET-F型，不同組間差異無統計學意義。根據以上結果，作者認為嗜血桿菌和假分枝桿菌可能是潛在的疾病指標，監測其絕對豐度可能有助于找到手足口病腸道類型的模型。