鹽酸右美托咪定對膿毒癥小鼠譫妄的防治作用

王舜 倪燕華 萬海方

膿毒癥是機體受到嚴重感染時，多種炎癥介質(zhì)釋放的全身炎性反應綜合征，內(nèi)環(huán)境平衡破壞，器官功能損傷。膿毒癥誘發(fā)的腦損傷可致注意力下降，記憶減退，譫妄甚至昏迷等精神障礙［1］亦是引起住院病人死亡的重要因素［2］。膿毒癥患者即使僥幸存活，亦可出現(xiàn)長期的諸如記憶減退，譫妄等認知功能障礙，造成患者較大的痛苦［1］。鹽酸右美托咪定主要特點無呼吸抑制副作用，鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮作用顯著，起效快，半衰期短，對神經(jīng)、心血管、泌尿系統(tǒng)各臟器可能具有一定的保護作用［3］。研究顯示，鹽酸右美托咪定對膿毒癥機體神經(jīng)及腦保護有重要作用，可以減輕膿毒癥誘發(fā)的腦損傷［4］。本文探討鹽酸右美托咪定防治膿毒癥小鼠譫妄發(fā)生的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 8~12周齡SPF級 C57BL/6N健康雄性小鼠64只購于常州文卡斯實驗動物有限公司，體重（25±1.5）g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2016-0010。動物使用許可證號：SYXK（浙）2020-0005。置于溫度（22±1）℃，濕度（60%±10%），光照（明，暗交替各12 h）環(huán)境下，自由飲水、普通顆粒飼料飼養(yǎng)1周。實驗過程中對動物的處置符合相關動物倫理學標準。

1.2 試劑和儀器 鹽酸右美托咪定注射液（江蘇揚子江藥業(yè)有限公司，批號：20061231）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（武漢賽培生物批號：SP13726）、白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒（武漢賽培生物批號：SP13701）；脂多糖［055：B5愛必信（上海）生物科技有限公司］；行為學儀器（上海欣軟信息科技有限公司）；正置光學顯微鏡（日本奧林巴斯 OLYMPUS CK31）；酶標儀（美國Bio-rad公司）；曠場箱與新物體識別箱購自上海軟隆。

1.3 方法 （1）分組：隨機數(shù)字表法將小鼠分為4組，空白對照組、藥物對照組、膿毒癥模型組、藥物保護組，每組各16只。每組再分為兩個亞組（各8只），進行曠場實驗與新物體識別實驗。（2）動物模型建立：參照文獻［5］膿毒癥模型組腹腔注射脂多糖（LPS）20 mg/kg建模；藥物保護組建模前15 min，腹腔注射40μg/kg鹽酸右美托咪定；空白對照組在相同時間腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，而藥物對照組相同時間腹腔注射等量鹽酸右美托咪定，給藥體積為50 mL/kg。（3）曠場實驗［6］：評估進入新環(huán)境后小鼠的緊張程度及探索新環(huán)境的自主行為。能夠比較客觀反應實驗動物進入陌生環(huán)境后的好奇度、行為習慣以及情緒變化。將實驗小鼠置于長40 cm，寬40 cm，高40 cm曠場內(nèi)記錄小鼠運動總距離、進入中央格的次數(shù)、中央格停留時間、垂直運動數(shù)、探索次數(shù)、糞便粒數(shù)，共5 min。下午1∶30~3∶30在安靜房間內(nèi)進行。（4）新物體識別實驗［7］：主要研究嚙齒動物對新物體的偏好，記憶力，注意力和焦慮程度。將小鼠放入測試實驗箱內(nèi)，并將該箱放置于避光、隔音場所。實驗過程進行3 d，分為適應期、熟悉期及測試期。適應期將實驗小鼠在空箱內(nèi)活動20 min。熟悉期將實驗小鼠放入有2個大小、外觀與材質(zhì)相同的實驗箱中活動。測試期替換熟悉期中的1個物體（大小、外觀與用材完全不同）位置不變，膿毒癥模型小鼠制成后，在3 h與24 h將小鼠放入箱內(nèi)同一位置，并記錄小鼠5 min內(nèi)探究新物的時間Tn與探究舊物的時間Tf。小鼠識別新舊物體的能力由偏好指數(shù)Tn/（Tn+Tf）表示［7］。每只小鼠實驗結束后，乙醇清理測試箱及物體清除異味避免干擾。（5）ELISA測定小鼠血清和海馬中炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平：戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉每組小鼠，從眼球取血，用TNF-α和IL-1β試劑盒按操作流程測定血清TNF-α和IL-1β水平。（5）病理檢測方法：建模24 h后，將處死的小鼠穿刺左心室0.9%氯化鈉溶液沖洗至液體澄清后甲醛灌注，解剖出小鼠海馬組織，新鮮組織固定于4%多聚甲醛＞24 h，將組織從固定液取出在通風櫥內(nèi)用手術刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織依次梯度酒精脫水、蠟塊包埋，將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4μm。切片漂浮于攤片機40℃溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進60℃烘箱內(nèi)烤片。待水烤干蠟烤化后取出。依次將切片放入二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ30 min，無水乙醇Ⅰ10 min，無水乙醇Ⅱ10 min，95%酒精5 min，90%酒精5 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，蒸餾水洗。切片入Harris蘇木素染5~10 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化5 s，流水沖洗5 min，氨水返藍3 min，流水沖洗。切片入伊紅染液中染色3 min后將切片放入酒精脫水透明、晾干，中性樹膠封片。正置光學顯微鏡觀察海馬組織結構。

1.4 觀察指標 （1）曠場實驗：比較四組小鼠運動總距離、進入中央格的次數(shù)、中央格停留時間、垂直運動數(shù)、探索次數(shù)、糞便粒數(shù)。（2）新物體識別實驗：比較四組小鼠識別新舊物體的能力。（3）比較四組小鼠造模24 h后血清及海馬組織TNF-α、IL-1β水平。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊時兩兩比較用SNK-q檢驗，方差不齊時用Tamhane T2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠曠場實驗 建模前各組小鼠指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。建模24 h后曠場實驗結果：與空白對照組比較，藥物對照組各項觀察指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；膿毒癥模型組進入中央格的次數(shù)，停留時間，垂直運動和糞便數(shù)量增加（P＜0.05），而運動總距離和探索次數(shù)減少（P＜0.05）；與藥物對照組比較，膿毒癥模型組進入中央格的次數(shù)，停留時間，垂直運動和糞便數(shù)量增加（P＜0.05），而運動總距離和探索次數(shù)減少（P＜0.05）；藥物保護組比膿毒癥模型組運動進入中央格的次數(shù)，停留時間，垂直運動和糞便均減少（P＜0.05），而運動總距離和探索次數(shù)增加（P＜0.05），差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表1 各組小鼠建模前曠場實驗結果比較（±s）

表1 各組小鼠建模前曠場實驗結果比較（±s）

組別 運動總距離（mm） 進入中央格次數(shù)（次） 中央格停留時間（s） 垂直運動數(shù)（次） 探索次數(shù)（次） 糞便粒數(shù)（粒）空白對照組（n=8） 16,120.50±1,876.74 23.88±2.03 23.00±1.31 23.75±2.49 6.00±1.31 3.75±1.03藥物對照組（n=8） 15,977.63±2,303.24 23.38±2.39 22.88±3.72 25.50±2.45 5.63±1.69 3.38±0.92膿毒癥模型組（n=8） 16,183.88±2,280.91 21.50±1.93 22.75±3.11 24.00±3.07 7.00±1.31 3.50±0.92藥物保護組（n=8） 17,081.38±2,298.78 22.63±2.67 23.13±2.90 24.50±2.45 6.38±1.69 4.13±0.84 F值 0.426 1.652 0.025 0.693 1.208 1.010 P值 0.736 0.200 0.995 0.564 0.325 0.403

表2 各組小鼠建造模24 h后曠場實驗結果比較（±s）

表2 各組小鼠建造模24 h后曠場實驗結果比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與藥物對照組比較，#P＜0.05；與膿毒癥模型組比較，△P＜0.05

組別 運動總距離（mm） 進入中央格次數(shù)（次） 中央格停留時間（s） 垂直運動數(shù)（次） 探索次數(shù)（次） 糞便粒數(shù)（粒）空白對照組（n=8） 10,280.88±819.60 11.63±2.67 13.13±2.90 18.25±3.46 7.50±1.19 2.63±0.52藥物對照組（n=8） 10,088.63±479.07 15.88±2.03 15.63±1.69 20.50±2.88 6.50±1.19 2.50±0.75膿毒癥模型組（n=8） 6,909.50±2,464.74*# 21.75±2.82*# 20.88±2.64*# 28.63±2.67*# 3.75±1.28*# 3.75±0.71*#藥物保護組（n=8） 10,042.50±885.75△ 12.50±2.45△ 12.63±1.68△ 22.06±5.17△ 6.00±1.31△ 2.75±0.46△F值 10.784 26.78 21.66 13.65 12.95 6.732 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.001

2.2 各組小鼠新物體識別實驗結果比較 與空白對照組比較，各組訓練階段總探索時間差異無統(tǒng)計學意義；3 h時與空白對照組比較，膿毒癥模型組偏好指數(shù)降低（P＜0.05），而藥物保護組小鼠較膿毒癥模型組小鼠明顯升高（P＜0.05），24 h時膿毒癥模型組小鼠及藥物保護組小鼠偏好指數(shù)較3 h時降低，與空白對照組比較，膿毒癥模型組偏好指數(shù)降低（P＜0.05），而藥物保護組小鼠較膿毒癥模型組小鼠明顯升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠新物體辨別實驗結果比較（±s）

表3 各組小鼠新物體辨別實驗結果比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與3 h比較，#P＜0.05；與膿毒癥模型組比較，△P＜0.05

組別 訓練階段總探索時間（S） 偏好指數(shù)3 h 24 h空白對照組（n=8） 170.13±5.44 64.88±2.29 59.88±1.25藥物對照組（n=8） 169.88±4.52 66.75±2.12 61.25±3.28膿毒癥模型組（n=8） 166.13±4.39 57.38±2.67* 49.13±2.03*#藥物保護組（n=8） 170.63±4.57 61.88±2.23△ 54.00±1.31#△F值 1.515 24.463 55.06 P值 0.232 ＜0.001 ＜0.001

2.3 各組小鼠海馬組織結構觀察 空白對照組小鼠海馬組織神經(jīng)細胞排列緊密整齊，細胞結構完整，細胞核清晰可見。藥物對照組小鼠海馬組織基本正常。膿毒癥模型組小鼠海馬組織神經(jīng)細胞排列紊亂，細胞間隙增大，細胞結構不清晰，細胞核固縮深染，神經(jīng)細胞變性，并伴有膠質(zhì)細胞浸潤。藥物保護組小鼠海馬組織神經(jīng)元排列相對規(guī)律整齊，細胞形態(tài)較正常，細胞間隙稍微增大，變性細胞較少。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬組織切片（Harris蘇木素染色 ×400）

2.4 各組小鼠血清及海馬組織中TNF-α和IL-1β水平 藥物對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；膿毒癥模型組和藥物保護組血清和海馬組織中的TNF-α和IL-1β高于對照組（P＜0.05）；藥物保護組低于膿毒癥模型組（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠造模24 h后血清及海馬組織TNF-α、IL-1β水平比較（±s）

表4 各組小鼠造模24 h后血清及海馬組織TNF-α、IL-1β水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與膿毒癥模型組比較，#P＜0.05

組別 血清（ng/L） 海馬組織（pg/mg·prot）TNF-α IL-1β TNF-α IL-1β空白對照組（n=8） 23.73±2.31 64.71±3.66 6.60±0.51 16.11±0.88藥物對照組（n=8） 36.46±11.5 70.40±5.33 6.92±0.64 15.53±0.92膿毒癥模型組（n=8）782.92±64.17* 151.08±16.18* 176.21±7.67* 52.13±3.72*藥物保護組（n=8） 181.81±18.48*# 77.95±7.75*# 66.53±8.73*# 18.16±1.67*#F值 893.87 143.58 1504.90 555.87 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

膿毒癥發(fā)病過程中，微血管屏障破壞、細胞缺氧、炎性體異常活化，炎癥因子TNF-α和IL-1β異常增加［8］，釋放出的炎癥因子導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)劇烈炎性反應，神經(jīng)元損傷、退行性改變甚至凋亡，最終導致人類及動物的學習和記憶能力減退、認知功能障礙［9］。本研究內(nèi)毒素腹腔注射制備膿毒癥模型，可較高程度模擬人體膿毒癥發(fā)病過程中代謝變化、細胞凋亡及重要臟器損傷。通過觀察膿毒癥模型小鼠認知功能、學習能力，記憶力和情緒變化與曠場實驗和新物體識別實驗變化，以評估實驗小鼠譫妄的發(fā)生率和嚴重程度。

鹽酸右美托咪定通過激動突觸前膜α2受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜以及交感抑制等重要作用［10］。近年來研究表明，右美托咪定可通過降低TNF-α、IL-2、IL-6和IL-1β等炎癥因子水平抑制圍術期炎性反應，可能與其交感抑制，減少炎癥因子釋放，提高血管反應等器官保護作用相關［11］。鹽酸右美托咪定包含能與苯二氮類受體結合的咪達唑侖環(huán)結構［12］，研究表明單一應用苯二氮 類藥物對膿毒癥患者鎮(zhèn)靜，未發(fā)現(xiàn)與右美托咪定對膿毒癥患者鎮(zhèn)靜相關的抗炎及神經(jīng)保護作用，推測相關保護作用與α2腎上腺素能受體激動密切聯(lián)系而與鎮(zhèn)靜作用無關［13］。

本研究結果顯示，膿毒癥小鼠血清炎癥因子與海馬組織內(nèi)炎癥因子均明顯升高，而藥物保護組血清及海馬組織炎癥因子水平則降低。新物體識別與曠場實驗表明膿毒癥引起小鼠嚴重的焦慮、認知功能下降，記憶力減退，對周圍環(huán)境不適應，譫妄明顯。鹽酸右美托咪定不影響小鼠的自主活動及探索行為，不會使小鼠焦慮，認知能力和記憶力發(fā)生改變。藥物保護組實驗小鼠的譫妄程度遠低于膿毒癥模型組，證明鹽酸右美托咪定可改善膿毒癥小鼠譫妄狀態(tài)，對于膿毒癥所致譫妄具有一定的防治作用。從高倍顯微鏡病理觀察可以得知膿毒癥引起小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重損傷。應用鹽酸右美托咪定保護可明顯減輕膿毒癥小鼠海馬組織的損傷，具有腦保護作用。

綜上所述，膿毒癥小鼠腦內(nèi)炎癥因子與譫妄有顯著相關性，而鹽酸右美托咪定降低腦內(nèi)炎癥因子則是防治膿毒癥相關譫妄發(fā)生的主要作用機制。本研究也有一定的不足之處，只進行了40μg/kg鹽酸右美托咪定的藥物保護，對鹽酸右美托咪定對膿毒癥相關譫妄的防治效果評價相對片面。在今后的研究中可以選用不同劑量鹽酸右美托咪定藥物保護，以期膿毒癥相關譫妄防治最佳劑量。