嗜酸浸礦細(xì)菌的定向富集篩選及對(duì)多金屬硫化礦尾礦的生物浸出特征

聶圓圓 王芷晴 譚曉桐 姜海強(qiáng) 安 龍 趙 鑫

(1.東北大學(xué)資源與土木工程學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110819;2.深部金屬礦山安全開采教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 沈陽(yáng) 110819)

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)和工業(yè)的日益發(fā)展,傳統(tǒng)粗放型的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)模式在資源開發(fā)與環(huán)境保護(hù)方面的矛盾日趨凸顯,長(zhǎng)期堆存的大量尾礦造成的環(huán)境負(fù)擔(dān)愈發(fā)嚴(yán)重。經(jīng)粗略統(tǒng)計(jì),目前我國(guó)大約存有1.3萬(wàn)座尾礦庫(kù),有超過70億t的尾礦堆存,其中,金屬尾礦占比超過90%[1]。由于早期選礦工藝落后,很多尾礦中仍含有大量貴金屬和稀土元素有待回收[2]。研究人員針對(duì)尾礦中有價(jià)金屬的回收開展了較多的研究,微生物浸出技術(shù)因其成本低、環(huán)境友好、原位浸出、產(chǎn)生有毒物質(zhì)較少、不涉及有毒化學(xué)品等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[2]。

生物浸出技術(shù)又稱濕式冶金技術(shù),利用微生物在生命活動(dòng)中自身的氧化和還原特性,使資源中目標(biāo)成分氧化或還原,在水溶液中以離子態(tài)或沉淀的形式與原物質(zhì)分離[3]。該技術(shù)主要應(yīng)用于低品位礦和尾礦。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)已有數(shù)十個(gè)低品位銅礦探索或成功應(yīng)用了生物浸銅技術(shù)[4]。尾礦中金屬的溶解不僅與礦物組成有關(guān),也取決于微生物的浸出能力[3]。嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans,At.f)是浸出硫化礦中有價(jià)金屬的重要功能菌,可以氧化FeSO4和硫化礦中的Fe2+、單質(zhì)硫、還原性化合物和硫化礦物等,獲得生長(zhǎng)所需的能量[5],在含有銅、鋅、鐵、鈷、鉬、鎳等金屬的礦物浸出領(lǐng)域有較多應(yīng)用。但是,環(huán)境中微生物的特定功能和效率會(huì)因其生長(zhǎng)和分離的環(huán)境存在較大差異,選擇適宜的環(huán)境,篩選獲得更加高效的浸礦功能菌種,對(duì)提升尾礦資源化具有重要意義。

本研究以山東省某金屬礦的酸性礦井水為接種物,定向富集并篩選獲得1株嗜酸鐵氧化細(xì)菌,通過理化特征和16S rDNA基因測(cè)序鑒定其屬于A.ferrooxidans。探究細(xì)菌接種量和礦漿濃度對(duì)其生長(zhǎng)活性和Cu2+、Zn2+浸出效率的影響。利用該細(xì)菌在最適生長(zhǎng)條件下,對(duì)金都礦業(yè)尾礦中的有價(jià)金屬進(jìn)行浸出,探究金屬的浸出效率與浸礦特征。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 尾礦樣品

試驗(yàn)尾礦采自金都礦業(yè)的多金屬硫化礦的尾礦庫(kù),經(jīng)研磨至粒度為 75μm。通過 X射線衍射(XRD)分析,主要成分為二氧化硅(SiO2)、黃鐵礦(FeS2)、黃銅礦(CuFeS2)和閃鋅礦(ZnS)等。采用X射線熒光光譜(XRF)分析顯示,Cu和Zn的含量分別為 4.65%和 2.50%,Fe、Al、Mg、Pb、Ti、Sb 的含量分別為33.99%、3.99%、1.04%、1.15%、0.07%、0.08%;SiO2和SO3的含量分別為21.09%和8.20%,其余是少量的非金屬元素。

1.2 接種物與培養(yǎng)基

富集接種物為山東省某金屬礦的酸性礦井水,深黃色,含有少量懸浮物,pH=2.7±0.2。使用9K培養(yǎng)基定向富集和篩選嗜酸浸礦功能細(xì)菌[6]。9K培養(yǎng)基制備方法為:將(NH4)2SO43.0 g、KCl 0.1 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g和Ca(NO3)20.01 g溶于600 mL去離子水,用1∶1的H2SO4調(diào)至pH=2.0,獲得基礎(chǔ)鹽溶液A液;FeSO4·7H2O 44.8 g溶于400 mL去離子水,同樣方法調(diào)至pH=2.0,獲得亞鐵溶液B液。溶液A于121℃高壓滅菌10min;溶液B使用0.22μm濾膜過濾滅菌,接種前混合兩種溶液。9K固體培養(yǎng)基:在未調(diào)pH值的A液中加入15 g瓊脂,高壓滅菌,待降溫至60℃,與經(jīng)過濾滅菌的B液混合,分裝入滅菌培養(yǎng)皿待用[6]。

1.3 功能菌的定向富集與分離純化

取5 mL接種物至100mL的9K培養(yǎng)基中,在30℃、140 r/min的恒溫空氣浴振蕩培養(yǎng),監(jiān)測(cè)Fe2+氧化速率判斷嗜酸性鐵氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。接種5 d后開始取樣,之后每天取樣1次,測(cè)定溶液的Fe2+濃度,計(jì)算Fe2+氧化率,至其趨近于100%時(shí)結(jié)束。為了提升目標(biāo)功能細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量,以第一輪富集菌液為接種物,以5%的接種量轉(zhuǎn)接入新的培養(yǎng)基,連續(xù)轉(zhuǎn)接多代并定向富集,直至功能細(xì)菌可以快速達(dá)到對(duì)數(shù)期。收集菌液,委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行MiSeq測(cè)序,進(jìn)行菌群分析,進(jìn)一步判斷定向富集效果。以富集效果較好的功能菌液為接種物,使用平板劃線法對(duì)目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行分離,恒溫培養(yǎng)至菌落形成,挑取外觀均勻的菌落,接種至9K液體培養(yǎng)基,30℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)至呈紅棕色,重復(fù)至菌株為純菌。

1.4 形態(tài)觀察與系統(tǒng)發(fā)育鑒定

離心收集對(duì)數(shù)期的菌體,使用PBS緩沖液沖洗2次,取1滴菌液置于銅網(wǎng)表面,使用2%磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染色40 s,風(fēng)干后使用透射電子顯微鏡(JEMARM200F,JEOL)觀察細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(D1600,Solarbio)提取基因組DNA。使用16S rDNA基因通用引物BSF8/27(5'-AGA GTT GAT CCT GGC TCA G)和BSR1492(5'-TAC GGY TACCTTGTT ACG ACT T)擴(kuò)增目標(biāo)基因[7]。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后,委托生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Blast_W與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì),使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5 微生物浸礦試驗(yàn)

向含有85mL的9K培養(yǎng)基的錐形瓶中加入10 g滅菌的尾礦砂,以體積分?jǐn)?shù)15%接種對(duì)數(shù)期菌液,礦漿濃度100 g/L,初始pH=2.0;空白對(duì)照組以無(wú)菌水代替菌液。30℃、130 r/min振蕩浸礦28 d。每2 d取樣1次,測(cè)定體系中Cu2+和Zn2+的含量。

1.6 測(cè)試分析方法

全部試驗(yàn)設(shè)置3組平行重復(fù)。使用pH計(jì)(PB-10,Sartorius)測(cè)定溶液的pH值[6];鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定溶液的Fe2+含量[5];X射線衍射(XRD)分析原礦樣的組成[8];電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)測(cè)定原礦樣和浸出液中銅和鋅的含量。金屬浸出率計(jì)算公式如下:

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 浸礦功能菌富集與篩選

2.1.1 菌株富集與純化

以酸性礦井水為接種物富集目標(biāo)細(xì)菌,通過監(jiān)測(cè)Fe2+氧化速率來考察浸礦功能菌的生長(zhǎng)情況。富集初期,細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢,第12 d觀察到菌液由淺綠色變?yōu)榧t棕色,此時(shí)Fe2+氧化率為39.55%,在第14 d時(shí),Fe2+氧化率達(dá)到99.5%。進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接富集以提升目標(biāo)細(xì)菌的適應(yīng)性和增殖速率,經(jīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接多代后,第1 d的Fe2+氧化率即可與富集初期第7 d的水平相當(dāng),且僅需2 d即可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,Fe2+可全部被氧化。對(duì)其中氧化效率最高的樣品進(jìn)行MiSeq測(cè)序,對(duì)比富集前后的菌群在屬水平的相對(duì)豐度差異,結(jié)果如圖1所示。原始接種物中含有的浸礦功能細(xì)菌包括Acidithiobacillus、Leptospirillum和Acidiphilium,所占比例分別為0.01%、0.37%和1.41%,經(jīng)定向富集后,Acidithiobacillus和Acidiphilium成為優(yōu)勢(shì)菌屬,分別占比43.58%和22.18%,Leptospirillum消失,推斷其原因是該菌屬不適宜所選富集條件。MiSeq測(cè)序結(jié)果表明,9K培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)細(xì)菌富集效果較好,Acidithiobacillus比例提升至富集前的7 000倍。采取平板劃線法在9K固體培養(yǎng)基上對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行分離純化,恒溫培養(yǎng)至第8 d時(shí)形成針尖大小的圓形菌落。挑取外觀均勻的菌落,分別接種至9K液體培養(yǎng)基中,30℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液呈紅棕色,重復(fù)此過程,最終純化獲得7株細(xì)菌,進(jìn)一步測(cè)定其Fe2+氧化速率,優(yōu)選出效率最高的菌株WT2020,在36 h內(nèi)的Fe2+氧化率可達(dá)99.49%。

圖1 富集前后的浸礦功能菌群組成Fig.1 Microbial diversity of before and after leaching enrichment

2.1.2 功能菌株的鑒定

菌株WT2020在9K固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢,35℃培養(yǎng)8 d形成直徑約0.5 mm的黃色圓形單菌落,表面濕潤(rùn)。 菌體約(0.2～0.4)×(1.0～1.2)μm,呈短桿狀,無(wú)鞭毛(如圖2所示)。

圖2 菌株WT2020的TEM顯微照片F(xiàn)ig.2 The TEM micrograph of strain WT2020

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株WT2020基因組DNA。獲得16S rDNA基因1458 bp的片段,與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系如圖3所示。同源比對(duì)分析顯示,與Acidithiobacillus ferrooxidansATCC 23270T(NR074193)的親緣性最近,相似度為99.52%;然后是A.ferriduransATCC 33020T(AJ278719),相似度為98.79%。結(jié)合其生理生化特征,判斷該菌株屬于氧化亞鐵硫桿菌屬,初步命名該菌株為A.ferrooxidansWT2020。目前,該菌屬僅發(fā)現(xiàn)9個(gè)菌種,彼此間16S rDNA基因相似度較高。

圖3 菌株W T2020的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系Fig.3 Phylogenetic relationship of strain WT2020

2.2 菌株WT2020的鐵氧化活性

生物浸礦過程容易受pH值、溫度、接種量和礦漿濃度等多種因素影響,前人的大量研究表明,浸礦細(xì)菌在pH=2.0、30℃時(shí)生長(zhǎng)活性最高,接種量和礦漿濃度對(duì)其生長(zhǎng)影響較大[8]。因此,菌株WT2020的最適接種量和礦漿濃度對(duì)后續(xù)研究和實(shí)際應(yīng)用有重要意義。

2.2.1 細(xì)菌接種量的影響

細(xì)菌接種量直接決定細(xì)菌的繁殖速度和生化反應(yīng)速率。考察接種量(0%、5%、10%、15%和20%)對(duì)菌株WT2020生長(zhǎng)的影響。如圖4所示,細(xì)菌進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的時(shí)間隨著接種量的增加而縮短,氧化效率也明顯提高。接種量為15%和20%時(shí),Fe2+氧化率在36 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定,接近100%,而接種量為5%和10%時(shí),則需要48 h,說明接種量較低會(huì)延長(zhǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)延滯期。但是,接種量過高不僅增加浸礦成本,而且某些具有抑制和毒害作用的代謝產(chǎn)物會(huì)隨接種物進(jìn)入浸礦體系,降低浸出效率[8]。因此,15%的接種量較為適宜。張旭[9]等探究接種量對(duì)以黃鐵礦培養(yǎng)Acidithiobacillus生長(zhǎng)的影響,在黃鐵礦礦漿濃度為10 g/L,溶液初始pH=2.0時(shí)獲得最佳接種量,為15%,與本研究結(jié)果相同。

圖4 接種量對(duì)菌株WT2020氧化活性的影響Fig.4 Effect of inoculum proportion on the oxidation activity of strain WT2020

2.2.2 礦漿濃度的影響

初始礦漿濃度會(huì)影響浸礦細(xì)菌的生長(zhǎng)活性和鐵氧化速率。 礦漿濃度(0、10、20、50和100 g/L)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響如圖5所示。加入礦樣后,菌株WT2020進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的時(shí)間推遲約12 h,說明氧化Fe2+的效率減弱。礦漿濃度越高,細(xì)菌氧化活性越低,但在60 h時(shí),Fe2+氧化率都能接近100%,說明雖然菌株WT2020的氧化速率降低,但是仍然可以在高礦漿濃度條件正常生長(zhǎng)。薛洪其[10]研究分離自鉬鎳礦廢水的At.f菌對(duì)Cu2+和Zn2+的耐受性發(fā)現(xiàn),At.f菌對(duì)Cu2+比較敏感,當(dāng)Cu2+濃度為5.0 g/L時(shí),細(xì)菌氧化活性受到明顯抑制。而At.f菌對(duì)Zn2+具有較高的耐受性,在Zn2+濃度為10 g/L的環(huán)境下培養(yǎng)80 h時(shí)的Fe2+氧化率仍在99%以上。WANG[8]等研究At.f菌在不同礦漿濃度條件下對(duì)黃銅礦和硫化銅尾礦中Cu2+的浸出率,當(dāng)黃銅礦中Cu2+濃度為16.48 g/L時(shí),Cu2+的浸出率在75 d達(dá)到47%,而當(dāng)Cu2+濃度為49.44 g/L時(shí),Cu2+的浸出率僅為20%;當(dāng)硫化銅尾礦中Cu2+的濃度為0.99 g/L時(shí),Cu2+的浸出率較其他Cu2+濃度(0.099、0.495 和 2.97 g/L)更高,達(dá)到68%。雖然,以上浸礦研究均使用了At.f菌,但是由于其分離來源不同,菌株表現(xiàn)出對(duì)重金屬的解毒能力不同,對(duì)相同金屬離子的耐受能力和浸出率也存在差異[11],其實(shí)質(zhì)是菌株的功能基因和蛋白活性的差異。與以往研究相比,菌株 WT2020可在 Cu2+濃度為3.78 g/L和Zn2+濃度為1.80 g/L時(shí)存活,并且具有較好的金屬耐受性和氧化速率。

圖5 礦漿濃度對(duì)菌株W T2020氧化活性的影響Fig.5 Effect of pulp density on the oxidation activity of strain WT2020

浸礦體系的pH受礦漿初始濃度的影響如圖6所示,均呈先上升后下降的趨勢(shì),且礦漿濃度與終點(diǎn)pH值呈反相關(guān)。原因是前期為細(xì)菌生長(zhǎng)的延滯期,產(chǎn)酸少于耗酸;當(dāng)細(xì)菌到達(dá)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期,利用FeSO4和尾礦中的Fe2+氧化產(chǎn)生大量Fe3+和H+(反應(yīng)如式(1)和(2)所示)[12],說明在不影響菌株生長(zhǎng)的前提下,礦漿濃度越高,浸出率越高。因此,礦漿濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)活性具有重要意義。在生物浸礦的實(shí)際生產(chǎn)中,礦漿濃度的降低必然導(dǎo)致處理量的減小,影響生產(chǎn)效益。所以,在保證細(xì)菌正常生長(zhǎng)的前提下,適當(dāng)增加礦漿濃度有利于浸出效率的提升。菌株WT2020在礦漿濃度為100 g/L時(shí)仍具有很強(qiáng)的金屬耐受性和氧化活性。

圖6 礦漿初始濃度對(duì)體系pH值的影響Fig.6 Effect of initial pulp densities on the system's pH value

2.3 對(duì)多金屬硫化尾礦的浸出

目前,最常用的生物浸出方式主要是直接浸出和間接浸出[4]。在直接浸出過程中,細(xì)菌將金屬硫化物氧化成可溶性硫酸鹽(式(3)和(4)所示);間接浸出過程則是細(xì)菌將溶液中Fe2+氧化成Fe3+后,Fe3+對(duì)金屬硫化物的氧化,如式(5)所示。

在細(xì)菌接種量為15%、礦漿濃度為100 g/L的條件下,Cu2+和Zn2+在28 d的浸出率分別為55.23%和72.09%,空白組的浸出率分別為46.66%和38.37%。浸出率變化如圖7所示,在兩個(gè)體系中,Cu2+和Zn2+的浸出率都隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,但是有菌條件下的浸出率明顯高于無(wú)菌條件。說明H+對(duì)尾礦中Cu2+和Zn2+的浸出占主導(dǎo)作用,菌株WT2020可通過自身代謝維持浸礦體系中適宜的酸度環(huán)境,產(chǎn)生的Fe3+可以持續(xù)氧化尾礦中的金屬,在后期可達(dá)到更好的金屬浸出效果。菌株WT2020具有強(qiáng)化硫化礦氧化的作用,并展現(xiàn)出很強(qiáng)的金屬離子耐受能力。Cu2+的浸出率低于Zn2+,推斷是由于金屬在尾礦中的存在形式和電化學(xué)特性之間復(fù)雜的相互作用導(dǎo)致[13]。NGUYEN等[14]研究不同菌株對(duì)某銅銀尾礦中 Mn2+、Zn2+和Cu2+的生物浸出,在利用不同的菌株和菌株組合的多次實(shí)驗(yàn)中,Cu2+的浸出率始終低于50%,而Mn2+的浸出率最高可達(dá)99.5%。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),可交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)和鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)的金屬比其他形式的金屬更容易進(jìn)入生物體被利用,而硫化物結(jié)合態(tài)、有機(jī)物結(jié)合態(tài)和殘留態(tài)的金屬則更穩(wěn)定,生物可利用性較差。另外,黃銅礦(CuFeS2)通常具有較高的電化學(xué)電位,較難被氧化,而閃鋅礦(ZnS)的電化學(xué)電位更低,易被氧化,因而 Cu2+和 Zn2+浸出效率不同[15]。

圖7 Cu2+和Zn2+浸出率變化Fig.7 Variation of Cu2+and Zn2+leaching rates

3 結(jié) 論

以酸性礦井水為接種物,定向富集并分離獲得1株嗜酸性鐵氧化細(xì)菌,鑒定并命名為Acidithiobacillus ferrooxidansWT2020。接種量和礦漿濃度對(duì)菌株WT2020的氧化活性和金屬的浸出率影響較大,最佳接種量和礦漿濃度分別為15%和100 g/L。在最佳接種量和礦漿濃度,30℃,130 r/min的條件對(duì)多金屬硫化尾礦浸礦28 d,Cu2+和Zn2+的浸出率分別達(dá)55.23%和72.09%。由于金屬的存在形式和電化學(xué)特性之間復(fù)雜的相互作用,以及菌株的喜好差異,導(dǎo)致不同金屬浸出率的差異,未來可以嘗試在不同生境條件下篩選更多的功能菌株,以菌種復(fù)配或微生物強(qiáng)化等技術(shù)針對(duì)性提升生物浸礦效率。