合并及非合并間質性肺病的RA、DM/PM、SSc患者血清TGF-β1和SP-D水平對比觀察

蔣真，李向培，劉娟，白文花

1 南京醫科大學附屬淮安市第一人民醫院免疫風濕科，江蘇 淮安 223300；2 徐州醫科大學附屬淮安醫院免疫風濕科；3 中國科學技術大學附屬安徽省立醫院風濕科

結締組織病（CTD）是指結締組織受累的疾病，包括類風濕關節炎（RA）、皮肌炎/多發性肌炎（DM/PM）、系統性硬化癥（SSc）等多種疾病。間質性肺病（ILD）是不同CTD 常見并發癥，也是影響患者預后的重要因素。RA、DM/PM、SSc 有不同ILD 患病率和嚴重程度，其中DM/PM 最易合并嚴重ILD。CTD 相關ILD（CTD-ILD）目前尚無有效的治療方法，但早期診斷、積極治療可明顯改善預后。轉化生長因子β（TGF-β）是系統性硬化癥相關間質性肺病（SSc-ILD）發病的關鍵介質［1］。TGF-β 信號活化招募免疫細胞，產生更多的TGF-β。TGF-β 增多導致成纖維細胞分化、轉化為肌成纖維細胞，刺激細胞外基質的合成、抑制基質金屬蛋白酶的合成［2］。在SSc-ILD 患者肺組織TGF-β 調節基因表達上調［3］。表面活性蛋白D（SP-D）是主要由肺泡Ⅱ型細胞分泌的一種表面活性蛋白，功能是減少肺泡氣/液表面張力，阻止小氣道塌陷［4］。SP-D 反映了毛細血管/肺泡屏障的損傷程度［5］。ILD 和SSc-ILD 患者血清SP-D 水平增加，可能反映了SSc 相關ILD 的嚴重程度［6］。盡管文獻報道多種CTD-ILD 標志物，但肺纖維化和肺損傷標志物TGF-β、SP-D 在不同ILD 中的表達水平差異如何尚不明確。本研究選取64 例CTD 患者（包括RA 12 例、DM/PM 26例、SSc 26 例），比較了合并及非合并ILD 的RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D 水平，旨在為臨床對CTD 并發ILD 的診斷和病情判斷提供參考指標。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019 年3 月—2020 年3 月淮安市第一人民醫院收治的CTD 患者64 例。納入標準：所有患者年齡≥16 周歲。RA 診斷參照2009年美國風濕病學會/歐洲抗風濕聯盟（ACR/EULAR）聯合制定的分類標準；DM/PM 診斷參照1975 年Bohan 和Peter 分 類 標 準；SSc 診 斷 參 照2013 年ACR/EULAR 聯合制定的分類標準。ILD 診斷參照Fleischne 學會命名委員會關于ILD 胸部高分辨CT（HRCT）術語的定義［7］。排除標準：所有患者均排除患有上述三類疾病中的兩種或三種疾病、排除合并其他自身免疫性疾病、排除合并腫瘤和（或）感染性疾病患者、排除合并其他肺部疾病。64例CTD 患者中，包括RA 12 例、DM/PM 26 例、SSc 26 例。RA 患者12 例［合并ILD（RA-ILD）5 例、非合并ILD 7例］，男0例，女12例；年齡（53.6±12.8）歲；病程84.00（11.00～210.00）個月。DM/PM 患者26例［合并ILD（DM/PM-ILD）19 例、非合并ILD 7 例］，男8 例，女16 例；年齡（45.5 ± 17.2）歲；病程12.00（4.75～48.00）個月。SSc 患者26 例［合并ILD（SSc-ILD）22 例、非合并ILD 4 例］，男2 例，女24 例；年 齡48.0（29.8～54.0）歲；病 程42.0（17.0～87.0）個月。本研究取得淮安市第一人民醫院倫理委員會同意，所有患者簽署知情同意書。

1.2 血清TGF-β1、SP-D 檢測方法 采用ELISA法。抽取治療前活動期患者清晨空腹肘靜脈血，離心獲取血清，標本按照1∶11 稀釋，即25 μL 血清+ 250 μL 稀釋液；標準品：原液濃度100 ng/mL，倍比稀釋（用稀釋液稀釋），溶解后需靜置15 min；洗液1∶10 稀釋（50 mL 原液+ 450 mL ddH2O）。實驗過程：1.每孔加100 μL 標本、標準品或空白對照，在搖床上室溫孵育2 h；2.洗板（5 次）后顛倒板子，倒盡液體，每孔加入100 μL生物素標記的抗體，在搖床上室溫孵育1 h；3.洗板（5 次）后顛倒板子，倒盡液體，每孔加入100 μL HRP-抗生蛋白鏈菌素復合物，在搖床上室溫孵育1 h；4.洗板（5 次）后顛倒板子，倒盡液體，避光每孔加入100 μL 底物，室溫孵育15 min，孵育過程中避免搖晃板子；5.每孔加入100 μL 終止液；6.設定酶標儀在450 nm 波長處，檢測每孔吸光度值；7.根據7 個標準品濃度及吸光度值（OD 值），繪制標準曲線及標準曲線方程；8.根據上述標準曲線計算每個標本濃度。

1.3 統計學方法 采用SPSS26.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以-x±s表示，組間比較采用t檢驗或方差分析；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whiney 檢驗或Kruskal-Wallis 檢 驗。P＜0.05 為 差 異 有 統 計 學意義。

2 結果

2.1 RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D 水平比較 RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D水平見表1，由表1 可知，RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D 水平比較均無統計學差異，P均＞0.05。

表1 RA、DM/PM、SSc患者血清TGF-β1和SP-D水平［ng/mL，M（P25，P75）］

2.2 合并及非合并ILD 的RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D 水平比較 合并及非合并ILD 的RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D 水平比較 見表2。

表2 合并及非合并ILD的RA、DM/PM、SSc患者血清TGF-β1和SP-D水平比較［ng/mL，M（P25，P75）］

3 討論

RA 是常見的CTD，較易合并ILD，部分患者病情較重，而SSc 和DM/PM 雖然發病率不高，但易合并ILD，且多為嚴重ILD，預后不良。CID-ILD 是影響不同CTD 預后的重要并發癥之一，特別是DM/PM-ILD 合并的快速進展性ILD（RP-ILD）短期內可導致患者呼吸衰竭、死亡。而ILD 標志物可提供重要的診斷和預后判斷信息，具有重要的臨床價值。CTD-ILD 的標志物文獻報道很多，如炎性肌病相關ILD 標志物：各種肌炎特異性抗體、肌炎相關抗體［8］，SSc-ILD 標志物抗拓撲異構酶抗體［9］，RA-ILD 標志物抗CCP 抗體［10］，另外還有表觀遺傳標志物miRNAs［11-12］等。這些標志物有重要的臨床意義，但可能只與相應的CTD-ILD 相關，是否存在與不同CTD-ILD 均相關的標志物尚不明確。

TGF-β 參與各種組織纖維化（包括SSc 肺纖維化）發病，而SP-D 直接由肺組織分泌，被認為是肺損傷重要標志物之一，因此這兩個標志物可能與CTD-ILD 相關性更強，成為本次研究關注的對象。TGF-β1可能在不同CTD 中與ILD 的相關性不同。TGF-β 是一個具有多種功能的細胞因子，在造血、血管生成、細胞增殖、分化、遷移和凋亡方面均發揮作用，對T 細胞作用的研究顯示其可能具有促炎或抗炎作用。TGF-β 有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種類型，也有三種TGF-β 配體，TGF-β1與配體結合后介導纖維化和疤痕形成，而TGF-β3可能參與無疤痕愈合［13］。另外研究［14］發現，TGF-β1與肝癌侵襲有關，RA 具有腫瘤樣的滑膜增殖和滑膜骨侵蝕，TGF-β1在RA 非合并ILD 患者中高表達是否與此相關值得進一步研究。ZHU 等［15］發現，RA 中TGF-β1通過TGF-β1/Smad 信號通路促進成纖維細胞樣滑膜細胞遷移和侵蝕。研究［16］發現，TGF-β1+ 869C/T 多態性增加北印度人RA 的易感性，并且TGF-β1的多態性與RA 疾病活動性相關，T 等位基因增加與高的炎癥活性、不良功能結局和更差的存活率相關，而CC 基因型或C 等位基因具有保護作用。因此，TGF-β1與RA 的相關性可能與其促炎和促進滑膜增殖和骨侵蝕有關。而TGF-β1在DM/PM 和SSc患者中的促纖維化作用可能與其在特定環境下與不同配體結合或與其基因的多態性有關，這值得進一步研究。SP-D 是由肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌的一種表面活性蛋白，參與降低肺泡氣/液表面張力、防止小氣道塌陷，血清中這些肺特異性蛋白水平反映了毛細血管/肺泡屏障的損傷程度［6］。在肺損傷的情況下，血清中SP-D 水平增加至少部分是由于產生增加和（或）滲入外周血所致［17］，因此可以作為ILD 損傷和預后判斷的一個標志物，但文獻研究大多來自SSc 相關ILD，少見在不同CTD-ILD 中表達的比較研究。

本研究發現，CTD 非合并ILD 者血清TGF-β1水平較CTD-ILD者升高，RA非合并ILD血清TGF-β1水平也較RA-ILD 者升高，因此TGF-β1似乎與CTD 相關的ILD 無明顯相關性。我們前期研究［18］發現，在RA、DM/PM、SSc 中，ILD 的發病率和嚴重性按此順序遞增。本研究發現，RA 患者血清TGF-β1水平較DM/PM、SSc 者升高，RA 非合并ILD 者較DM/PM 非合并ILD 者、SSc 非合并ILD 者升高，支持TGF-β1與CTD-ILD 不相關這一觀點。因此，TGF-β1在不同CTD 與ILD 相關性不同，如在RA 中可能與ILD 相關性不大，而在DM/PM 和SSc 中可能與ILD 相關，上述結果可能與TGF-β 有3 種類型和3 種配體，以及TGF-β1的多態性有關［13-16］。本研究還發現，CTD-ILD者血清SP-D 水平較CTD 非合并ILD 者升高，各CTD-ILD 者也較相應CTD 非合并ILD 者升高，并且RA-ILD 組較RA 非合并ILD 組明顯升高，差異有統計學意義，支持SP-D對CTD-ILD的作用，并且對不同CTD-ILD的作用強度可能不同。文獻［19-21］報道，SP-D水平也受SP-D 基因多態性的影響。本文結果顯示，血清SP-D 水平在不同CTD-ILD 中的差異可能與此有關。

總之，合并及非合并ILD 的RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D水平存在差異，檢測兩指標有助于不同CTD-ILD的病情判斷。