靶向融合肽對裸鼠順鉑耐藥卵巢癌移植瘤生長的抑制作用及其機制

袁金，康佳麗，王小霞

華南理工大學附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510180

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生與癌基因的激活、抑癌基因的失活以及異常細胞信號通路的激活有關［1-6］。大多數(shù)卵巢癌患者易復發(fā)，對化療有耐藥性，鉑類耐藥患者預后差，對進一步化療的反應率低，且中位生存期低于12 個月［7］。本課題組前期研究將可特異結(jié)合卵巢癌細胞的短肽［8］與廣譜的細胞穿膜肽、可誘導腫瘤細胞凋亡的絲裂原活化蛋白激酶激酶6 的組成性突變體重組，構建成靶向融合肽（MAP2K6-FP）［9］。前期研究表明，MAP2K6-FP 能在體外水平增加耐藥性卵巢癌細胞對順鉑（DDP）的敏感性。本實驗擬從體內(nèi)水平研究MAP2K6-FP 對順鉑耐藥細胞的生長抑制作用。本研究以裸鼠為實驗對象，腹腔注射人卵巢癌順鉑耐藥細胞株（SKOV3/DDP）制備順鉑耐藥卵巢癌移植瘤模型，注射1 周后尾靜脈注射0.25 mg/kg的MAP2K6-FP，觀察MAP2K6-FP 對裸鼠順鉑耐藥卵巢癌移植瘤生長的抑制作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 MAP2K6-FP及SKOV3/DDP細胞 MAP2K6-FP為本課題組前期通過原核表達的方法成功構建，保存于-20 ℃環(huán)境中。SKOV3/DDP 細胞購于北京市腫瘤醫(yī)院。用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640 培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2培 養(yǎng)箱中。

1.2 實驗動物 SPF 級雌性BALB/C nu/nu 裸鼠14 只，4～6 周齡，體質(zhì)量（14 ± 0.96）g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心［SCXK（粵）2008-0002］，在廣州醫(yī)科大學實驗動物中心［YXK（粵）2010-0104］進行SPF 級飼養(yǎng)（實驗動物合格證號：440072000，動物實驗證明編號：00066334）。斑馬魚受華中科技大學生命科學技術學院惠贈，并以自然成對交配的方式在本實驗室進行繁殖。依照國際AAALAC 的要求，其飼養(yǎng)條件為28 ℃，pH 值6.9～7.2，硬度53.7～71.7 mg/L CaCO3 的養(yǎng)魚用水（200 mg 速溶海鹽加入1 L 反滲透水以維持為480～510 μS/cm電導率）。

1.3 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基和胰蛋白酶-EDTA（0.25%∶0.2%）購自美國Sigma 公司；多克隆兔抗人VEGFR-3、LYVE-1、EGFR3 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；鼠抗人D2-40及β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京博奧森生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒和SP 試劑盒購自北京碧云天生物有限公司。

1.4 裸鼠順鉑耐藥卵巢癌模型制備、MAP2K6-FP注射方法及移植瘤、淋巴管相關指標觀察 ①裸鼠順鉑耐藥卵巢癌模型制備、MAP2K6-FP 注射方法：SKOV3/DDP 細胞經(jīng)胰酶消化后，用PBS 洗3次，然后用生理鹽水稀釋細胞懸液。每只裸鼠腹腔 內(nèi) 注 射 200 μL 的 SKOV3/DDP 細 胞（5×106/mL）。腹腔內(nèi)注射SKOV3/DDP 細胞1 周后，將制模成功的裸鼠隨機分為兩組（各7 只）。觀察1 組尾靜脈注射0.25 mg/kg 的MAP2K6-FP，每周2 次；對照1 組尾靜脈注射5 mL/kg 的生理鹽水，每周2次；共注射4 周。②裸鼠腹圍測量及腹水量、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤體重量記錄：每周測量3 次裸鼠腹圍。治療1 個月后（腹腔注射細胞后5 周），統(tǒng)一處死全部裸鼠，解剖并記錄裸鼠腹水量、腫瘤播散器官數(shù)（如大網(wǎng)膜、腸系膜、腹壁、橫膈、肝、脾、肺和腎等有腫瘤生長的部位）和瘤結(jié)節(jié)數(shù)量（腹腔可見數(shù)個米粒至豌豆大小的瘤體）。剝離出移植瘤（腫瘤結(jié)節(jié)及裸鼠肝、脾、腎、肺等主要臟器），石蠟包埋，用作后續(xù)免疫組化實驗。③裸鼠移植瘤中血管內(nèi)皮生長因子特異性受體3（VEGFR-3）、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1（LYVE-1）、唾液酸糖蛋白（D2-40）及表皮生長因子受體3（EGFR3）檢測：a.VEGFR-3、LYVE-1、D2-40：采用免疫組化SP 法。以PBS 緩沖液作為陰性對照，按照試劑盒說明書進行操作。在400 倍光學顯微鏡視野下，每100 個腫瘤細胞中胞質(zhì)及胞膜呈棕黃染色的細胞比例＜10%為陰性，≥10%為陽性。腫瘤組織中VEGFR-3、LYVE-1、D2-40 的平均灰度值由圖像分析系統(tǒng)全自動測定。VEGFR-3、LYVE-1以陽性率表示（棕黃色顆粒占比），D2-40 以個/視野表示。b.EGFR3：采用蛋白印跡法。取移植瘤組織，用RIPA 裂解液裂解并提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。取30μg 進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。繼之在4 ℃進行200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜2 h。經(jīng)1 h 室溫封閉后，與EGFR3 一抗（1∶1 500）4 ℃孵育過夜，并以β-actin 作為內(nèi)參照（1∶2 000）。次日二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h 后將PVDF 膜經(jīng)化學發(fā)光劑處理，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光并采集圖像，各條帶的平均A 值由Image J 圖像分析軟件測定。EGFR3以相對表達量表示。

1.5 斑馬魚淋巴管生成情況觀察 將所收集的斑馬魚卵置于培養(yǎng)皿的Egg water 中，在普通體視顯微鏡下觀察斑馬魚的生長情況。斑馬魚以自然成對交配的方式進行繁殖，受精后24 h后更換Egg water，并將魚卵放置于12 孔板中，每孔18～20 枚。受精后2、3、4 d 時更換培養(yǎng)液，受精后4 d 將斑馬魚卵隨機分成2 組（每組20 尾），觀察2 組加入20 mmol/L 的MAP2K6-FP，對照2 組加入等量生理鹽水，后置于28.5 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。把斑馬魚置入冰水中麻醉，將麻醉的斑馬魚胚胎置于滴加了3%的甲基纖維素的透明載玻片上，觀察兩組斑馬魚淋巴管生成情況，并照相。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以-x±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠腹圍、腹水量、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤體重量比較 裸鼠腹圍、腹水量、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤體重量比較見表1。

表1 兩組裸鼠腹圍、腹水量、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤體重量比較（±s）

表1 兩組裸鼠腹圍、腹水量、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤體重量比較（±s）

注：與對照1組比較，*P＜0.05。

組別觀察1組對照1組腹圍（mm）73.00±1.23*84.00±3.60腹水量（mL）0.29±0.03*1.16±0.15轉(zhuǎn)移器官數(shù)（個）2.80±0.44*7.20±0.44瘤結(jié)節(jié)數(shù)（個）44.60±3.51*115.00±4.85瘤體重量（g）0.30±0.03*1.28±0.33

2.2 兩組裸鼠移植瘤中VEGFR-3、LYVE-1、D2-40、EGFR3 表達比較 觀察1 組VEGFR-3 陽性率27.1%、LYVE-1 陽性率32.3%、D2-40（3.10±0.72）個/視 野、EGFR3 0.22 ± 0.01，對 照1 組 分 別 為73.8%、80.3%、（9.31 ± 1.68）個/視 野、0.34 ±0.02，兩組比較，P均＜0.05。

2.3 兩組斑馬魚淋巴管生成情況比較 觀察2 組魚腹部不能形成連續(xù)的管腔，對照2 組魚腹部可見三條管腔伴行。

圖1 斑馬魚外形和熒光鏡下斑馬魚淋巴管情況

3 討論

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生與癌基因的激活、抑癌基因的失活以及異常細胞信號通路的激活有關［6］。大多數(shù)卵巢癌患者易復發(fā)，對化療有耐藥性，鉑類耐藥患者預后差，對進一步化療的反應率低，且中位生存期低于12 個月［7］。獲得性耐藥已成為卵巢癌治療中的一個重要問題，普遍存在化療耐藥（順鉑、紫杉醇等），部分原因是卵巢癌細胞線粒體內(nèi)活性氧生成減少［10］。有研究［11］表明，卵巢癌化療耐藥性的原因可能是參與對化療引起的DNA 損傷反應的修復通路的冗余，這些通路可能是并行作用的，如果負責觸發(fā)鉑化療后細胞死亡的修復通路缺乏，另一種替代修復通路會補償并驅(qū)動癌細胞修復損傷，導致化療耐藥性，因此推動DNA 修復通路對鉑化療或靶向治療的敏感性，從而可以克服卵巢癌化療耐藥。卵巢癌患者對鉑類化療藥產(chǎn)生耐藥性具有復雜性，包括不同種類的疾病，目前遠遠沒有被完全理解。因此，我們迫切需要研究卵巢癌的化療耐藥機制，以克服卵巢癌治療效果差和患者預后不良的問題。

本課題組前期通過原核表達的方法成功構建MAP2K6-FP，其是一種特異性靶向卵巢癌的具有細胞殺傷力的融合肽，在體外水平能通過誘導卵巢癌細胞的自噬性死亡而增加其對DDP 的敏感性。本實驗我們一方面構建順鉑耐藥卵巢癌移植瘤模型，以便更清楚地觀察MAP2K6-FP 對順鉑耐藥卵巢癌在體內(nèi)的作用，另一方面應用斑馬魚模式生物模型進一步驗證MAP2K6-FP 在淋巴管發(fā)生過程所起的作用［12-13］。本實驗發(fā)現(xiàn)，MAP2K6-FP 作用于順鉑耐藥卵巢癌移植瘤后，觀察1 組細胞的生長速度明顯慢于對照1 組，腹圍增長緩慢。至治療結(jié)束后剖腹觀察觀察1組裸鼠腹水量明顯小于對照1組，腫瘤播散器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)總數(shù)及瘤體總重量均明顯低于對照1 組。這些大體觀察結(jié)果均表明，MAP2K6-FP 能夠抑制順鉑耐藥卵巢癌移植瘤的生長。分析其機制，可能與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移相關。

研究［14-17］顯示，LYVE-1 和D2-40 是近些年來發(fā)現(xiàn)的兩個重要的淋巴管標志物。相對腫瘤新生血管研究而言，卵巢癌的淋巴管轉(zhuǎn)移方面的研究卻甚少，長期以來對淋巴轉(zhuǎn)移規(guī)律及處理重視不夠，認識不深。在轉(zhuǎn)基因鼠和其他體外模型中的研究已證實腫瘤主要通過表達于淋巴管內(nèi)皮細胞上的VEGFR-3信號途徑誘導淋巴管生成。而利用VEGF受體抑制劑來抑制腫瘤組織和淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴管新生能有效抑制早期腫瘤的轉(zhuǎn)移［18-20］。本文結(jié)果顯示，VEGFR-3、LYVE-1和D2-40 在淋巴管內(nèi)皮細胞膜和胞質(zhì)呈棕黃色，觀察1組的陽性率均低于對照1組。觀察1組D2-40為（3.10±0.72）個/視野，對照1組中為（9.31±1.68）個/視野，且管腔內(nèi)未見紅細胞填充。MAP2K6-FP作用于順鉑耐藥移植瘤后，VEGFR-3、LYVE-1 和D2-40 表達均下降，提示MAP2K6-FP 能夠一定程度抑制淋巴管生成。臨床上卵巢癌的轉(zhuǎn)移性極高并常見轉(zhuǎn)移至腹部大網(wǎng)膜。這種遷移機制依賴于轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞對表皮生長因子受體家族相關基因的表達上調(diào)作用，尤其是增加EGFR3 的表達［17］。本研究中MAP2K6-FP 作用于順鉑耐藥移植瘤，移植瘤組織中EGFR3 的表達較對照1 組低，提示MAP2K6-FP 能夠抑制EGFR3的表達，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

本實驗進一步發(fā)現(xiàn)，觀察2 組20 mmol/L 的MAP2K6-FP 作用于斑馬魚后，可見明顯的斑馬魚形態(tài)的變化，出現(xiàn)心包積液及胸導管分離的情況，在熒光體式顯微鏡下進行淋巴管的觀察，可以觀察到淋巴管的生成受到抑制，沒有形成連續(xù)的管腔；而對照2 組的斑馬魚發(fā)育過程沒有很大的影響，魚腹部可見三條管腔伴行。實驗結(jié)果提示MAP2K6-FP 能夠抑制斑馬魚淋巴管的生成，進一步印證上述機制。

總之，MAP2K6-FP 可以抑制裸鼠順鉑耐藥卵巢癌移植瘤生長，機制可能是通過抑制淋巴管生成而實現(xiàn)；斑馬魚淋巴管生成受MAP2K6-FP抑制可進一步印證上述機制。