分離自院內(nèi)感染患者不同標本的KP生物被膜形成能力及對常用抗菌藥物耐藥率觀察

稅劍，向延根，石國民，喻容，潘建華

1 長沙市中心醫(yī)院檢驗科，長沙 410004；2 南華大學附屬長沙中心醫(yī)院檢驗科

生物被膜是指細菌為適應周圍環(huán)境，黏附于接觸介質(zhì)表面，不斷繁殖并分泌大量胞外基質(zhì)（多糖、蛋白、脂質(zhì)、胞外DNA 等）將其緊緊包裹形成致密的、三維立體膜狀結(jié)構(gòu)［1-2］。細菌形成生物被膜后可以阻礙抗菌藥物滲透，使細菌耐藥性增加10～1 000倍，導致慢性感染遷延不愈，使臨床抗感染變得更加棘手［3-4］。肺炎克雷伯菌（KP）是臨床常見的條件致病菌，廣泛存在于自然界，以及人體腸道、呼吸道、泌尿生殖道等處［5］。KP 生長條件要求低，適應能力強，常定植于機體或生物材料表面形成生物被膜，導致機體發(fā)生慢性持續(xù)性感染［6-7］。KP 耐藥機制比較復雜，水解酶或鈍化酶的產(chǎn)生、外膜孔蛋白的缺失、抗菌藥物主動外排、抗菌藥物作用靶點改變等均可導致KP耐藥，而目前關(guān)于生物被膜形成強弱程度對KP 耐藥性影響的研究較少。本研究選取96 株KP作為實驗對象，采用結(jié)晶紫染色法檢測菌株的生物被膜形成能力，另采用Vitek2Compact 全自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)進行細菌鑒定及藥物敏感性試驗，并比較了不同生物被膜形成能力的KP對常用抗菌藥物的耐藥率。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 96 株肺炎克雷伯菌分離自長沙市中心醫(yī)院2021年6—9月院內(nèi)感染患者各類標本，其中71株來源于患者呼吸道標本，18株來源于患者尿液，3 株來源于患者血液，2 株來源于患者腹水，2 株來源于患者分泌物。所有菌株均經(jīng)法國生物梅里埃公司Vitek2Compact 全自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)鑒定到種。 質(zhì)控菌株為ATCC27853、ATCC25922購自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。

1.2 主要試劑及儀器 0.1%結(jié)晶紫染液、LB 培養(yǎng)基為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；血平板為鄭州安圖工程股份有限公司產(chǎn)品。Vitek2Compact 全自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)、GN 鑒定卡、ASTN335 藥敏卡、比濁儀均為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；多功能酶標儀為深圳市匯松科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；臺式恒溫振蕩培養(yǎng)箱為金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱為賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；96 孔聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板為無錫耐思生命科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 KP生物被膜形成能力檢測 采用結(jié)晶紫染色半定量法。參考文獻［8-9］方法并作改進。將KP 轉(zhuǎn)種至血平板上37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落接種至5 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下以200 r/min的速度振蕩培養(yǎng)18 h，用LB液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液為0.5麥氏濁度備用。吸取菌液200μL加入96 孔細胞培養(yǎng)板，每株菌做3 個復孔，3 個陰性對照孔每孔加入200 μL 的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。吸走液體培養(yǎng)基，生理鹽水清洗培養(yǎng)孔3 次，去除浮游菌，自然晾干。每孔加入0.1%結(jié)晶紫200μL 染色15 min，棄去染液，流水緩慢沖洗3 次除去未結(jié)合的染料，自然晾干。每孔加入95%酒精200μL 脫色混勻10 min，酶標儀570 nm 處比色讀取吸光度（A）值。KP 成膜能力分級，不成膜：A≤Ac；弱成膜：Ac＜A≤2Ac；中等成膜：2Ac＜A≤4Ac；強成膜：A＞4Ac。陰性對照的平均A值加上其標準差定義為Ac。

1.4 KP耐藥性檢測 采用法國梅里埃公司生產(chǎn)的Vitek2Compact 全自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)進行藥敏試驗。具體步驟：用無菌棉拭子取足夠量的KP 純菌落，放到試管的生理鹽水里，用渦旋振蕩器使其充分混勻，用電子比濁儀調(diào)整菌液濁度至0.5麥氏單位。取配好的0.5麥氏菌懸液145μL，加到另一裝有3 mL 生理鹽水的試管中。將鑒定試劑卡和鑒定用菌懸液放到試劑卡架上，藥敏卡及藥敏菌液放在鑒定卡的右邊，將試劑卡架放到儀器中自動填充，24 h 后自動讀取藥敏結(jié)果。檢測抗菌藥物包括哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、美羅培南、妥布霉素、左氧氟沙星、米諾環(huán)素、復方新諾明、頭孢他啶、頭孢比肟、亞胺培南、阿米卡星、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、多粘菌素B，替加環(huán)素。藥敏結(jié)果判定參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）2020年標準進行。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率（%）表示，比較采用Fisher確切概率法或χ2分割法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 KP 生物被膜形成情況 不成膜菌株8 株（8.3%），結(jié)晶紫染色后吸光度值為0.154 3±0.006 9；弱成膜菌株14 株（14.6%），結(jié)晶紫染色后吸光度值為0.227 1±0.057 9；中等成膜菌株39 株（40.6%），結(jié)晶紫染色后吸光度值為0.527 4 ± 0.090 2；強成膜菌株35 株（36.5%），結(jié)晶紫染色后吸光度值為0.997 7 ± 0.447 5。KP 結(jié)晶紫染色結(jié)果，見圖1。ICU 病房（包括綜合ICU、EICU、RICU、神內(nèi)ICU、神外ICU）分離出KP 37 株，其中34（91.9%）株能形成生物被膜；普通病房（包括呼吸內(nèi)科、消化內(nèi)科、腎內(nèi)科、內(nèi)分泌科、普外科、骨科、神經(jīng)外科等非ICU 科室）分離出KP 59 株，其中54（91.5%）株形成生物被膜；ICU 病房分離出的KP 生物被膜形成能力與普通病房組比較，P＞0.05。

圖1 KP結(jié)晶紫染色結(jié)果

2.2 KP 對常用抗菌藥物的耐藥率 KP 對左氧氟沙星、復方新諾明、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素具有較高的耐藥率，耐藥率分別為44.8%、43.7%、50.0%、45.8%；對美羅培南、亞胺培南、阿米卡星、多粘菌素B、替加環(huán)素耐藥率較低，耐藥率分別為18.7%、18.7%、12.5%、1.0%、4.2%。

2.3 不同生物被膜形成能力的KP對常用抗菌藥物的耐藥率比較 不同生物被膜形成能力的KP 對哌拉西林/他唑巴坦（χ2=16.862，P=0.001）、頭孢哌酮/舒 巴 坦（χ2=14.258，P=0.003）、氨 曲 南（χ2=9.431，P=0.024）、美羅培南（χ2=17.671，P=0.001）、復方新諾明（χ2=9.315，P=0.025）、頭孢他啶（χ2=10.318，P=0.016）、頭 孢 比 肟（χ2=9.088，P=0.028）、亞胺培南（χ2=14.663，P=0.002）、阿米卡星（χ2=15.918，P=0.001）、環(huán)丙沙星（χ2=9.070，P=0.028）、多西環(huán)素（χ2=9.031，P=0.029）的耐藥率不同，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。KP 對上述11 種抗菌藥物的耐藥率不隨生物被膜形成能力增強而升高，其中弱成膜組菌株耐藥率最高，高于各組菌株（P均＜0.05）；中等成膜組菌株耐藥率（除亞胺培南外）高于不成膜組及強成膜組（P均＜0.05）；強成膜組菌株（除頭孢哌酮/舒巴坦、美羅培南、亞胺培南外）耐藥率高于不成膜組（P均＜0.05）。

3 討論

生物被膜是細菌為適應周圍不利環(huán)境而出現(xiàn)的一種特殊生存形式，是細菌及其自身分泌的胞外基質(zhì)組成的三維立體結(jié)構(gòu)性生物群落。細菌生物被膜常導致感染遷延不愈，使慢性感染治療變得更加棘手，臨床上80%的慢性感染與生物被膜密切相關(guān)［10］，而且生物被膜通過各種機制增加細菌的耐藥性。細菌生物被膜的形成主要包括三個階段：一、浮游菌的聚集、黏附階段；二、細胞外基質(zhì)分泌、被膜形成階段；三、生物被膜成熟、分散階段［11-12］。有文獻［3］報道，生物被膜內(nèi)細菌對抗生素的耐藥性比浮游菌高10～1 000 倍，其主要原因有兩個：一、抗菌藥物滲透障礙學說，生物被膜中含有大量蛋白質(zhì)、多糖、胞外DNA 等物質(zhì)，可以有效減緩抗菌藥物的滲透，降低其中抗菌藥物的濃度；同時生物被膜的某些組分可以結(jié)合抗菌藥物，阻礙抗菌藥物接觸細菌。研究［13］證實，生物被膜組分如藻酸鹽可以結(jié)合氨基糖苷類抗生素，從而阻礙妥布霉素等的滲透。二、營養(yǎng)限制學說，細菌形成生物被膜后，被膜底層細菌由于缺氧、缺營養(yǎng)，長期處于休眠狀態(tài)（稱之為饑餓細胞），這種狀態(tài)下的細菌對抗菌藥物不敏感［14］。文獻［15］證實，環(huán)丙沙星可以滲透進入生物被膜內(nèi)部，但不能有效殺滅生物被膜底層的細菌。在臨床抗感染治療中，有時會出現(xiàn)某種抗菌藥物體外敏感，但是抗感染效果不盡如意，其主要原因可能是細菌形成了生物被膜，使該藥物的抗感染效果降低所致。本研究通過96 孔細胞培養(yǎng)板體外構(gòu)建生物被膜，發(fā)現(xiàn)絕大數(shù)KP 能夠形成生物被膜，此結(jié)果與研究［16-17］結(jié)果相近。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同成膜能力的KP 對部分抗菌藥物的耐藥性不同，但是耐藥性與其成膜能力的強弱程度相關(guān)不明顯。ALCáNTAR-CURIEL 等［18］發(fā)現(xiàn)，KP 形成生物被膜影響其耐藥性，但生物被膜形成能力強弱程度與耐藥性不成線性相關(guān)。由此說明，KP 生物被膜形成可能對某種或某幾種抗菌藥物的抗菌活性產(chǎn)生影響，導致耐藥性升高。而其他抗菌藥物耐藥性增加可能是由于其他耐藥機制導致或其他耐藥機制起主要作用所致。

KP 是臨床常見的條件致病菌，由于近年廣譜抗菌藥物的大量使用甚至濫用，導致多重耐藥菌不斷出現(xiàn)，給臨床抗感染治療帶來極大困難。本研究顯示，KP 對左氧氟沙星、復方新諾明、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素的耐藥性較高，對美羅培南、亞胺培南、阿米卡星、多粘菌素B、替加環(huán)素保持較高的敏感性，此結(jié)果與馬紅葉等［19］的研究結(jié)果相近，結(jié)果提示KP耐藥形式依然嚴峻，臨床抗感染過程中應根據(jù)藥敏結(jié)果慎用耐藥性高的藥物，抗菌藥物使用過程中應結(jié)合藥敏試驗結(jié)果進行目標治療。尤其對于泛耐藥KP 感染的治療，需要結(jié)合藥物的最低抑菌濃度值進行聯(lián)合用藥。ICU 是綜合性醫(yī)院重要的搶救單元，住院患者病情嚴重、基礎(chǔ)疾病復雜、免疫力低下。入院后通常會使用大量廣譜抗菌藥物進行抗感染治療，從而誘導一系列耐藥機制產(chǎn)生，導致KP對抗生素的敏感性降低；另外，ICU 患者通常需要進行一系列有創(chuàng)操作（氣管插管、動靜脈導管等）維持患者生命，這些有創(chuàng)操作破壞了機體的物理保護屏障，往往會增加細菌定植于生物材料表面或患者傷口創(chuàng)面的機會，從而形成生物被膜，阻礙抗菌藥物滲透，導致慢性感染遷延不愈。KP 是臨床常見的條件致病菌，容易定植在生物材料或機體表面形成生物被膜，導致抗生素敏感性下降。本研究發(fā)現(xiàn)，ICU 分離的KP 菌株生物被膜形成能力與普通病房菌株比較，差異不顯著。由此說明，生物被膜不是引起ICU 病房KP 耐藥性升高的主要因素，ICU病房KP 耐藥性升高可能與入院后廣譜抗菌藥物的大量使用有關(guān)。

總之，KP 大多能形成生物被膜，對各種抗菌藥物呈不同程度耐藥，應加強醫(yī)院感染管理，有效控制生物被膜感染；KP生物被膜形成不受菌株科室來源影響，且菌株生物被膜形成能力影響細菌耐藥性，但耐藥性與生物被膜形成能力強弱相關(guān)不明顯，具體關(guān)系及機制還有待后續(xù)進一步研究。