卡維地洛預處理的人臍靜脈內皮細胞低密度脂蛋白誘導損傷情況觀察

徐紅，補娟，閆凱欣，周玲

1 新疆維吾爾自治區人民醫院老年醫學中心，烏魯木齊 830001；2 新疆維吾爾自治區人民醫院基礎醫學教育中心

動脈粥樣硬化（AS）是脂質成分持續在血管內膜累積，逐漸在血管內壁形成動脈粥樣硬化斑塊的疾病，是許多心腦血管疾病發生發展的重要病理生理基礎［1］。當血管內皮細胞受到損傷時，其通透性在高脂、活性氧、促炎細胞因子等因素的刺激下會進一步增大，進而導致炎癥細胞浸潤和脂質成分累積于血管壁受損處，導致血管內壁增厚，管腔發生狹窄，促進AS 的發生［2］。在進行血管內皮細胞實驗時，通常選用的細胞模型為人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）建立模型，其具有干細胞的潛能，能夠多次進行傳代［3］。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）能引起內皮細胞發生損傷，從而使脂質成分、炎癥細胞在損傷局部浸潤，并促進AS的形成，在AS的發生過程中有著非常關鍵的作用［4］。他汀類藥物常用于治療AS，其能夠降低血脂，緩解疾病的進展，但存在肌肉毒性反應、血糖升高和糖尿病、肝腎功能異常及腦卒中等不良反應?？ňS地洛對鈣離子通道有阻斷作用，其通過α1受體阻斷作用和非選擇性的β受體阻斷作用而引起兩種毛細血管的擴張，減少外周阻力和降低血壓?？ňS地洛不僅能擴張冠狀動脈及腎血管，降低外周血管阻力，還能降低體循環和肺循環阻力，在心力衰竭的基礎研究［5］以及臨床治療急性心肌梗死［6］中具有抗炎和抗氧化作用。2020 年12 月—2021年5月，我們以HUVECs 為實驗對象，給予不同濃度卡維地洛干預，后以ox-LDL 誘導細胞損傷，觀察卡維地洛預處理的HUVECs ox-LDL 誘導損傷情況。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器 HUVECs 購買自凱基生物有限公司。DMEM（高糖）培養基和胰酶（0.25%Trypsin-EDTA）、青霉素—鏈霉素雙抗（10 000 U）均為美國Gibco 公司產品，胎牛血清（FBS）購自Excell Bio 公司，PBS 磷酸鹽緩沖液粉劑為北京中杉金橋生物產品，DMSO（細胞凍存液）購自Sigma 公司，CCK-8 細胞增殖/毒性檢測試劑盒購自全式金生物公司，ox-LDL 購自廣州奕元生物公司，卡維地洛購自北京巨能制藥公司，LDH 檢測試劑盒為歐易生物科技有限公司產品，油紅O 染色試劑盒購自南京建成公司，15 mL 離心管、2 mL 凍存管、25 cm2培養瓶均購自Corning 公司。O2細胞培養箱（型號：Smart Cell HF-90）、生物安全柜及臺式低速離心機（型號：DK-80）購自上海力康儀器有限公司，-20 ℃低溫冰箱（型號：BCD-249LCK）、-80 ℃低溫冰箱（型號：DW-HL388）來源于合肥美菱公司，手動單道移液器購自Eppendorf 公司（型號：Research plus），液氮罐購自成都金鳳儀器廠（型號：YDS-50-125），熒光倒置顯微鏡來源于日本尼康公司（型號：Eclipse TS100-F），酶標儀采購自Bio-Rad 公司（型號：xMarkTM）。

1.2 HUVECs 培養 HUVECs 培養于DMEM（高糖）培養基+10%FBS+1%PS中，培養環境為37 ℃、5%CO2、飽和濕度。

1.3 HUVECs 分組、卡維地洛給予方法、ox-LDL 誘導及細胞活性檢測 采用微板法。取生長狀態良好匯合率達90%的HUVECs，按5×104個細胞/孔，接種于96孔板，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中培養24 h。將細胞分為5 組，A、B、C 組（測定組）分別加入5、10、20 μmol/L 卡維地洛預處理6 h，再加入100μg/mL 的ox-LDL 誘導培養24 h；D 組（對照組）加入100 μg/mL 的ox-LDL 誘導培養24 h；E 組（空白組）加入不含細胞的DMEM（高糖）培養基；每組3 個重復。對細胞進行離心處理10 min。每孔小心轉移20μL 上清至96 孔板中。再加入25μL 反應混合液，室溫孵育15 min，避光操作。用酶標儀在450 nm 處檢測所有樣本的OD 值。計算細胞活性，LDH 濃度（U/L）=（測定組OD 值-對照組OD值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）/×標準品濃度（0.2 μmol/mL）×1 000。以LDH 濃 度 反 映 細 胞活性。

1.4 HUVECs 分組、卡維地洛給予方法、ox-LDL 誘導及細胞增殖率測算 采用CCK-8 法。取生長狀態良好匯合率達90%的HUVECs，按5×104個細胞/孔，接種于96 孔板，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中培養24 h。分組及干預方法同“1.3”。待干預完成后，棄去培養基，各孔均加入100 μL 配置好的10%CCK-8 溶液，培養1 h 后放入酶標儀，測定450 nm 處的OD 值。計算細胞增殖率，細胞增殖率（%）=（實驗組OD 值-空白組OD值）/空白組OD 值×100%。A、B、C、D 組是實驗組，E 組為空白組。

1.5 HUVECs 分組、卡維地洛給予方法、ox-LDL 誘導及胞內脂滴形成情況觀察 采用油紅0 染色法。取生長狀態良好匯合率達90%的HUVECs，按5×104個細胞/孔，接種于96 孔板，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中培養24 h。分組及干預方法同“1.3”，每組3 個重復，干預完畢后，丟棄培養基，用PBS進行2次沖洗；將細胞用4%的甲醛固定液500μL固定、沖洗，然后加入油紅O染液對先前處理的細胞進行染色，染色時間設置為10 min。丟棄染液，PBS洗2 次，棄多余的染料，然后加入500μL 復染液，染色1 min，PBS洗2遍，用倒置顯微鏡觀察胞內脂滴形成情況（反應卡維地洛對氧化低密度脂蛋白誘導的HUEVCs 損傷的保護作用，抑制脂滴形成，減輕動脈粥樣硬化），并拍照。

1.6 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組LDH 活性比較 A、B、C、D、E 組LDH 活性 分 別 為（201.802 ± 27.738）、（226.126 ±12.483）、（253.521 ± 26.871）、（310.811 ±32.880）、（194.595±16.878）U/L，B、C、D 組分別與E組比較，A、B、C組分別與D組比較，P均＜0.05。

2.2 各組細胞OD 值及增殖率比較 細胞OD 值及增殖率比較見表1。

表1 各組細胞OD值及增殖率比較（±s）

表1 各組細胞OD值及增殖率比較（±s）

注：與E 組比較，△P＜0.05；與D 組比較，▲P＜0.05；與A 組比較，▽P＜0.05。

組別A組B組C組D組E組OD值0.637±0.044▲0.586±0.022▲▽0.611±0.036△▲0.507±0.035△0.685±0.042細胞增殖率（%）-7.085±6.426▲-14.404±3.243▲▽-10.842±5.203▲-26.044±5.095-

2.3 各組細胞胞內脂滴形成情況比較 與E 組比較，D 組細胞內紅色脂滴積累顯著增加；與D 組比較，A、B、C組細胞保內脂滴形成明顯減少，其中以A組抑制脂滴積累效果最為明顯（詳見圖1）。

圖1 各組胞內脂滴形成情況（油紅0染色，×200）

3 討論

AS 是一種臨床常見的好發于大、中動脈的疾病，以動脈內膜脂質沉積、粥樣斑塊形成為特征，是冠狀動脈疾病、腦梗塞和外周動脈硬化等疾病的重要病理基礎。既往多用他汀類藥物對AS 進行治療，具有較理想的臨床療效，但仍偶有肝酶增高、肌肉酸痛等不良反應。故為更好提供藥物治療的理論依據，本實驗選用HUVECs 來構建細胞模型進行研究。多項細胞實驗均以ox-LDL 誘導內皮細胞損傷模型，作為研究AS 病理生理機制及防治手段的細胞模型［7-8］。本實驗參考ZENG［9］等學者的研究結果，細胞模型的建立選用100 mg/L 的ox-LDL 培養HUVEC 細胞24 h，細胞活力均明顯降低，表明ox-LDL 誘導HUVEC 損傷造模成功，后續將在該模型中研究內皮損傷的防治手段，進而為AS 的防治提供依據。

卡維地洛是臨床常用的第三代β 受體阻滯劑，對于高血壓及心肌梗死引起的心室重構具有改善作用［10-11］。在體外和體內研究中，均觀察到了卡維地洛對于內皮細胞損傷的多種保護作用［12］。先前有臨床研究［13］表明，卡維地洛對阿霉素引起的HUVECs損傷有一定的保護作用。同樣有研究［14-15］證實，卡維地洛通過作用于HUVECs 線粒體，發揮對細胞的保護功能和心臟、外周血管疾病的改善作用。也有研究［16］發現，卡維地洛對AS 大鼠的動脈病理改變具有一定的改善作用。故本研究將ox-LDL 誘導的HUVECs 損傷來作為AS 的模型，以LDH 活性水平、細胞增殖情況、以及脂滴的形成程度作為觀察指標，以卡維地洛作為藥物干預措施，旨在研究卡維地洛對ox-LDL 誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的抑制作用。

正常情況下，LDH 不能透過細胞膜流出胞外，但當細胞受到損傷時，LDH 能夠釋放到細胞外，故LDH 水平的增高提示細胞活性的減低。本研究顯示，與E 組比較，B、C、D 組LDH 活性增強；與D組比較，A、B、C 組LDH 活性減弱；與E 組比較，C、D 組OD 值減小；與D 組比較，A、B、C 組細胞OD 值及增殖率增加；與A 組比較，B 細胞OD 值及增殖率減小；與E 組比較，D 組細胞內紅色脂滴積累顯著增加；與D 組比較，A、B、C 組細胞保內脂滴形成明顯減輕，其中以A 組抑制脂滴積累效果最為明顯。提示卡維地洛能夠抑制ox-LDL 誘導的HUVECs 細胞受損，促進細胞增殖，抑制胞內脂滴的形成，其中以A 組的作用效果最為顯著，證實卡維地洛對ox-LDL 誘導的HUVECs 發生的AS 有保護作用。同樣有研究［16］表明，適當濃度的卡維地洛對AS 的保護作用更加理想，與本研究實驗結果吻合。由此我們認為，ox-LDL 能夠對HUVECs 造成損傷，降低細胞活性，抑制細胞增殖，促進脂滴的形成，為AS 疾病的形成提供基礎，而卡維地洛能對ox-LDL 誘導的HUVECs 的損傷發揮一定的保護作用。

本研究僅顯示卡維地洛對ox-LDL 誘導的HUVECs 發生的AS 具有保護作用，但尚未探討其具體機制。有文獻［17］表明，卡維地洛也許是通過作用于NF-κB/COX-2/iNOS 途徑來發揮其抗氧化和抗炎的作用。研究顯示，卡維地洛能通過抑制乙二醇引起的組織學擾動和腎臟的NF-κB、p65等炎癥因子表達，以及血清部分細胞因子水平的表達，來發揮其抗炎抗氧化作用［18］。相信隨著研究的深入，特別是對其作用機制的系統探索，將為AS的臨床治療提供新的途徑。

總之，卡維地洛預處理可以減弱ox-LDL 誘導HUVECs 損 傷，尤 以 濃 度 為5 μmol/L 時 效 果最佳。