吡非尼酮與侖伐替尼聯合應用對人膽管癌細胞系HuCCT1的增殖克隆抑制作用及其機制

李麗萍，蒲詩云，任常諭，周永杰，周后鳳

1 成都市第五人民醫院藥劑科，成都 611130；2 四川大學華西醫院衛生部移植工程與移植免疫重點實驗室病理研究室

膽管癌是一種原發性膽道惡性腫瘤，近年發 病率呈逐漸上升趨勢，其發病隱匿，臨床表現一般不明顯，大多數患者發現時已進入晚期階段，手術切除根治難度大［1］。放化療成是膽管癌患者主要后期治療手段，但臨床上缺乏有效的化療、靶向治療策略。侖伐替尼（Len）是一種新型口服的多靶點酪氨酸激酶抑制劑。近年肝癌、膽管癌等難治性腫瘤的臨床前期應用研究顯示，Len 具有一定的腫瘤生長抑制能力［2］。吡非尼酮（PFD）是一種TGFβ 通路的靶向藥，臨床上主要用于治療肺纖維化。本團隊前期研究證實，PFD 對膽管癌細胞具有抑制作用［3］。藥效增敏和克服耐藥是提高腫瘤靶向治療效果的主要策略之一，PFD 是否可以增敏Len 對膽管癌的抑制能力，目前還不清楚。2021 年3—9 月，我們觀察了PFD 聯合Len 對人膽管癌HuCCT1 細胞增殖、克隆形成的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器 人膽管癌細胞系HuCCT1 細胞購自中國科學院細胞庫。PFD（批號HY-B0673）、Len（批號HY-10981）以及巴佛洛霉素A1（Baf.A1，批號HY-100558）均購自MCE生物公司，RPMI1640 細胞培養基和胎牛血清購自Hyclone 公司，細胞轉染試劑Lipofectamine 2000 購自Thermo 公 司，CCK-8 檢 測試劑 盒、DAPI 染 色液均購自上海碧云天生物技術有限公司，GAPDH抗體購自成都正能生物技術有限責任公司，p-AMPKα（Thr172）和p-S6（Ser235/236）抗體購自Cell Signaling Technology 公 司，AMPKα、p-mTOR（Ser2448）、mTOR 和RPS6/S6 抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司。CO2恒溫培養箱為新加坡ESCO 公司，多功能酶標儀為美國BioTek 公司，膠成像系統為美國Bio-Rad 公司，倒置熒光顯微鏡（Eclipse 80i 熒光顯微鏡）為日本Nikon 公司，配備CCD 高清相機。

1.2 HuCCT1 細胞培養 HuCCT1細胞培養于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，置于37℃含5%CO2的細胞培養箱。細胞轉染用Lipofectamine 2000轉染試劑，轉染過程嚴格按照說明書進行操作。

1.3 HuCCT1 細胞分組及PFD、Len 給予方法和細胞增殖活力測算 HuCCT1 細胞接種至96 孔板，每孔3 000 細胞，細胞培養24 h，后進行分組及藥物處理。PFD 聯合濃度梯度的Len 分組：對照組加入DMSO，PFD 為0.5 mmol/L 的PFD，PFD 聯合Len 組分別為0.5 mmol/L 的PFD 聯合不同濃度的Len（2、5、10、20μmol/L）。Len 聯合濃度梯度的PFD 分組：對 照 組 加 入DMSO，Len 單 藥 組 為10 μmol/L的Len，Len 聯合PFD 組分別為10 μmol/L 的Len 聯合不同濃度的PFD（0.1、0.25、0.5、1 mmol/L）。藥物處理48 h，棄去培養基，加入CCK-8 稀釋液，然后避光37 ℃孵育2 h，利用酶標儀檢測反應液450 nm處的OD值。計算細胞增殖活力，細胞增殖活力（%）=（實驗組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD值）×100%。

1.4 HuCCT1 細胞分組及PFD、Len 給予方法和細胞克隆形成數目觀察 HuCCT1 細胞接種至6 孔板中，每孔2 000 細胞，細胞培養24 h，后進行分組及藥物處理。對照組加入DMSO，PFD 單藥組為0.5 mmol/L 的PFD，Len 單 藥 組 為2 μmol/L的Len，聯 合 組 為0.25 mmol/L 的PFD 聯 合2 μmol/L 的Len。培養7 d，棄去培養基，PBS 溶液清洗3 次，甲醇固定20 min，結晶紫染色液染色30 min，PBS 清洗至背景干凈，然后拍照記錄，并記錄克隆形成數目。

1.5 HuCCT1 細胞分組及PFD、Len 給予方法和細胞自噬能力觀察 HuCCT1 細胞接種至含有玻璃片的24孔板中。細胞過夜培養后，根據轉染試劑說明書，轉染GFP-LC3 表達質粒。轉染24 h 后，后進行分組及藥物處理。對照組加入DMSO，PFD 單藥組為0.5 mmol/L 的PFD，Len 單 藥 組 為10 μmol/L的Len，聯合組為0.5 mmol/L的PFD 聯合10μmol/L的Len。藥物處理48 h 后，棄去培養基，PBS 清洗3次，4%多聚甲醛固定，然后利用DAPI 溶液染色5 min。將染色后的細胞培養玻片固定于載玻片。熒光顯微鏡觀察細胞，并進行拍照記錄。隨機選取5 個細胞統計分析GFP-LC3 陽性自噬體數目，以此指示細胞自噬水平。

1.6 HuCCT1 細 胞 分 組 及PFD、Len 給 予 方 法和細胞p-AMPK、p-mTOR、p-S6、LC3B-Ⅱ蛋白檢測 HuCCT1細胞接種至6孔板中，每孔1×105細胞，細胞培養24 h，后進行分組及藥物處理。對照組加入DMSO，PFD 單藥組為0.5 mmol/L 的PFD，Len 單藥組為10 μmol/L 的Len，聯合組為0.5 mmol/L 的PFD 聯合10 μmol/L 的Len。細胞經藥物處理48 h后，預冷PBS 清洗3 次，冰浴環境下細胞裂解液裂解30 min。在4 ℃環境下，以12 000 r/min 的轉速離心15 min，收集上清液。BCA 法測定蛋白濃度后，SDSPAGE電泳，轉膜。含有5%BSA的TBST溶液室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜。室溫孵育二抗1 h。ECL顯色試劑盒顯影曝光。采用ImageJ 軟件分析目的蛋白灰度值，以p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-S6/S6的比值分別表示AMPK、mTOR、S6蛋白的磷酸化水平，以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表示LC3-Ⅱ的表達水平，以Baf.A1處理時LC3-Ⅱ的表達水平評估細胞自噬水平。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖活力比較 0 μmol/L Len +0.5 mmol/L PFD、2μmol/L Len+ 0.5 mmol/L PFD、5 μmol/L Len + 0.5 mmol/L PFD、10 μmol/L Len +0.5 mmol/L PFD、20μmol/L Len+ 0.5 mmol/L PFD各處理組及空白對照組的細胞增殖活力分別為（95.30 ± 4.50）%、（61.18 ± 8.85）%、（40.79 ±8.12）% 、（25.05 ± 3.99）% 、（9.65 ± 4.08）% 、（100.00± 0）%，各聯合組與Len 單藥組比較，P均＜0.05。 10 μmol/L Len + 0 mmol/L PFD、10μmol/L Len+ 0.1 mmol/L PFD、10μmol/L Len+0.25 mmol/L PFD、10 μmol/L Len + 0.5 mmol/L PFD、10μmol/L Len+1 mmol/L PFD 各處理組及空白對照組細胞增殖活力分別為（61.97 ± 4.91）%、（45.67 ± 2.71）%、（34.21 ± 4.10）%、（26.50 ±3.98）%、（12.48 ± 4.74）%、（100.00 ± 0）%，PFD 單藥組與空白對照組比較，各聯合組與PFD 單藥組比較，P均＜0.05。

2.2 各組細胞克隆形成數目比較 聯合組、PFD單藥組、Len 單藥組、對照組細胞克隆形成數目分別為（43.00 ± 11.53）、（1 424.00 ± 50.21）、（870.00 ±76.54）、（1 488.66 ± 158.85）個，聯合組與對照組、單藥組比較，P均＜0.05。

2.3 各組細胞自噬體數目及LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量比較 聯合組、PFD 單藥組、Len 單藥組、對照組自噬體數目分別為（52.60 ± 10.11）、（20.20 ±4.49）、（7.40 ± 3.21）、（7.00 ± 2.92）個，聯合組與對照組、單藥組比較，P均＜0.05。細胞LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量比較見表1。

表1 各組細胞LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量比較（±s）

表1 各組細胞LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與PFD 單藥組比較，ΔP＜0.05；與Len單藥組比較，#P＜0.05。

組別聯合組PFD單藥組Len單藥組對照組Baf.A1（-）0.56±0.02*Δ#0.12±0.03 0.17±0.02 0.11±0.03 Baf.A1（+）0.94±0.03*Δ#0.76±0.06*0.57±0.04 0.57±0.05

2.4 各組細胞p-AMPK、p-mTOR、p-S6 蛋白相對表達量比較 細胞p-AMPK、p-mTOR、p-S6 蛋白相對表達量比較見表2。

表2 各組細胞p-AMPK、p-mTOR、p-S6蛋白相對表達量比較（±s）

表2 各組細胞p-AMPK、p-mTOR、p-S6蛋白相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與PFD 單藥組比較，ΔP＜0.05；與Len單藥組比較，#P＜0.05。

組別聯合組PFD單藥組Len單藥組對照組p-AMPK 1.46±0.01*Δ#0.61±0.05*0.94±0.08*0.01±0.00 p-mTOR 0.34±0.18*Δ#0.50±0.07*0.51±0.02*1.01±0.02 p-S6 0.02±0.00*Δ#0.46±0.04*0.22±0.00*0.70±0.12

3 討論

膽管癌是肝膽系統中常見的惡性腫瘤，近年國內外的膽管癌發病率呈現逐漸上升的趨勢。由于膽管癌發病隱匿，患者確診往往處于晚期，所以手術根治的概率較低，目前患者5 年生存率不到5%［1］。除手術之外，基于小分子化合物的靶向治療是另一種重要的治療手段。但是，目前尚無有效的針對膽管癌的靶向藥物。因此，尋找新型靶向藥物和開發有效的藥物治療策略將有助于提高膽管癌的治療效果。藥效增敏是提高抗腫瘤藥物抑癌能力的主要途徑，其中不同作用靶點的藥物間的聯合用藥是主要策略之一。

Len 是一種多靶點的酪氨酸激酶抑制劑，其于2018 年被美國食品藥品監督管理局批準用于治療分化型甲狀腺癌。在肝細胞癌方面，Len 被證實具有一定的治療效果，并被推薦用于不可切除肝細胞癌的一線治療［4］。近期研究［5-6］報道，Len 能夠使膽管癌患者獲益。本研究發現，Len 對膽管癌HuCCT1細胞的生長增殖具有一定的抑制作用，但抑制率較低（48 hIC50在微摩爾級別）。PFD 作為肺纖維化治療的特效藥，被證實具有毒副作用小的特點。近年多項臨床前實驗研究揭示［7-9］，PFD 具有抗腫瘤效果。我們的前期研究證實，PFD 可以抑制HuCCT1細胞的生長、增殖、侵襲及EMT 進程，但是其藥物作用濃度較高，作用36 h的IC50高為1.36 mmol/L［3］，這為臨床應用帶來一定的困難。本研究顯示，與單藥作用比較，低劑量的PFD 聯合Len 將顯著抑制HuCCT1 細胞的生長與增殖。自噬是細胞的一種重要的生理活動，細胞通過“自我吞噬”的方式降解清除壞損的細胞器、生物大分子等物質，進而完成物質能量的回收利用以及降低細胞損傷［10］。然而過度的細胞自噬將激活細胞的死亡程序（如細胞凋亡），促進細胞“自我毀滅”［11］。在腫瘤治療中，靶向激活腫瘤細胞的過度自噬是一種有效的治療策略［12-14］。本研究發現，PFD聯合Len可顯著提高HuCCT1細胞中自噬水平，提示PFD 聯合Len 可能通過過度激活細胞自噬，降低細胞的活力和抑制細胞的增殖。

AMPK-mTOR 信號軸是腫瘤細胞生長的重要調控通路。AMPK 是細胞應答能量變化的中樞調控分子。當細胞中能量（如葡萄糖、氨基酸等）匱乏時，能量感知因子通過信號傳遞，激活AMPK，進而調控細胞中線粒體、核糖體、蛋白質等代謝活動，指導細胞維持基本的生命活動，或啟動細胞 死 亡（如 凋 亡、壞 死、自 噬 等）［15-16］。 然而，mTOR 通過組裝形成mTORC1 和mTORC2 復合體，激活或抑制下游信號傳遞，進而增強細胞的代謝活動及促進細胞的生長與增殖［17］。腫瘤細胞的生長依賴于高糖環境，AMPK-mTOR 信號軸表現為AMPK 抑制、mTOR 激活的狀態［18-19］。所以，激活腫瘤細胞的AMPK、抑制mTOR 將有助于抑制腫瘤細胞的生長。另外，AMPK-mTOR 信號軸也是細胞自噬的重要調控通路。激活的AMPK一方面通過磷酸化自噬發生關鍵調控蛋白（如ULK1、Beclin1 等），促進細胞自噬的起始與發生；另一方面，AMPK 通過抑制細胞中mTOR 的信號通路，加劇自噬的發生及自噬流的進程，最終促進細胞自噬［20］。本研究發現，PFD 和Len 單藥處理HuCCT1 細胞后，AMPK 的磷酸化水平上調，mTOR 及其下游分子S6 的磷酸化水平下調，提示兩種單藥處理都將不同程度的激活AMPK 和抑制mTOR。本研究還發現，與單藥組比較，PFD和Len 聯合用藥將顯著上調AMPK 的磷酸化水平，下調mTOR 和S6 的磷酸化水平，提示聯合用藥進一步的激活AMPK、抑制mTOR。此外多項Len 耐藥相關研究指出，抑制mTOR 可以降低Len 的耐藥，進而提高Len 對腫瘤細胞的殺傷效力［21-23］。這些研究結論提示，本研究所提出的藥物聯合方案也將為解決Len 治療腫瘤過程中的耐藥問題提供一種新的思路。

總之，低劑量的PFD 聯合Len 可有效抑制膽管癌HuCCT1 細胞的生長和增殖，上調細胞的自噬水平，作用機制可能是通過上調AMPK的磷酸化水平，下調mTOR 的磷酸化水平，進而抑制mTOR 信號通路。