氧糖剝奪不同時間再灌注后對PC12細胞炎癥反應的影響

施誠龍，高永軍，王 振，陳景策，陳 沖，徐 蔚

(昆明醫科大學第二附屬醫院 神經外科，云南 昆明 650101)

缺血性卒中(Ischemic Stroke，IS)是世界范圍內最重要的死亡和殘疾原因之一[1]。在IS中，氧氣和葡萄糖供應不足會在幾小時內造成腦損傷，然而，腦卒中后缺血/再灌注引起的神經元損傷是一個多因素共同作用的過程，其中炎癥反應是最主要的機制之一[2]。在IS后24 h內，循環中的白細胞能夠穿透受損的腦實質，釋放補體因子和炎性細胞因子，如白細胞介素-1受體相關激酶1(IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK1)和TNF-a[3]。大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(Pheochromocytoma cells，PC12 cells)細胞是體外卒中模型中最常用的神經細胞系之一[4]，本研究采用體外培養的PC12細胞制作氧糖剝奪再灌注(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型來模擬體內腦缺血再灌注損傷，觀察不同時長OGD/R后PC12細胞的形態改變以及細胞炎癥因子IRAK1和TNF-a在mRNA水平上的表達，以探討OGD/R對PC12細胞炎癥反應的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、試劑、儀器

PC12細胞購自于中科院昆明細胞庫，編號為KCB200736YJ。主要試劑：胎牛血清、DMEM培養基、CCK-8試劑盒；mRNA的實時熒光定量多聚酶鏈式反應(Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR)使用SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit試劑盒和BlazeTaqTMSYBR? Green qPCR Mix 2.0試劑盒；相關引物由生物公司合成。主要儀器：倒置顯微鏡、酶標板自動讀數儀、實時熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

PC12細胞使用DMEM完全培養基在37 ℃、95%濕度、5% CO2的條件下培養，24 h換液，培養2～4 d傳代。

1.2.2 OGD/R模型建立及分組

根據OGD的時間不同將實驗細胞隨機分為5組(每組均進行6次實驗)：Normal組、OGD 3 h組、OGD 6 h組、OGD 12 h組和OGD 24 h組。建立OGD/R模型：將原培養基換成無糖DMEM培養基培養于94% N2、5% CO2和1% O2條件下模擬PC12細胞OGD損傷，OGD不同時間培養之后換用完全培養基置于37 ℃、95%濕度、5% CO2恒溫箱中復糖復氧繼續培養24 h，于倒置顯微鏡下觀察OGD不同時間再復糖復氧培養后PC12細胞形態學變化及處理送檢。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活力

將細胞以5×103/孔的密度接種于96孔細胞培養板，按上述干預后每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于37℃、95%濕度、5% CO2的恒溫箱中繼續孵育2 h并用酶標儀測定在450 nm處的吸光值，計算細胞活性。

1.2.4 QRT-PCR檢測mRNA表達水平

OGD/R處理后，收集細胞用Trizol法提取RNA，紫外分光光度計測定各樣本中RNA濃度及純度后將其反轉錄為cDNA，然后使用BlazeTaqTMSYBR?Green qPCR Mix 2.0試劑盒對cDNA進行實時定量擴增，PCR引物序列，見表1。采集記錄熒光，制作擴增曲線和溶解曲線，讀取Ct值，用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同時長OGD/R后PC12細胞形態學改變

未進行OGD/R處理的PC12細胞在倒置顯微鏡下觀察生長良好，形態正常，細胞間相互連接交織成網狀，密度高，細胞體飽滿舒展，折光性好，從胞體發出長短不一且有分枝的突起。進行OGD/R處理的細胞，隨著OGD時間的延長，PC12細胞損傷逐漸明顯且細胞密度逐漸降低，間隙增大，樹突和軸突回縮，細胞皺縮變圓，體積變小，OGD 3 h后復糖復氧主要表現為細胞樹突和軸突部分回縮，細胞固縮，OGD 6 h后復糖復氧細胞樹突和軸突回縮較OGD 3 h明顯且固縮更為嚴重，細胞部分漂浮，OGD 12 h和OGD 24 h后復糖復氧與前2組比較出現更為明顯且范圍更廣的樹突和軸突回縮及細胞固縮等結構破壞，有大量細胞碎片出現，見圖1。

2.2 不同時長OGD/R后PC12細胞活性的改變

與Normal組相比OGD/R組細胞活力逐漸降低(P<0.05)，Normal組和OGD 3 h組細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)；OGD 6 h組、OGD 12 h組、OGD 24 h組與Normal組相比存活率明顯降低(P<0.01)，見表2、圖2。

表2 CCK-8試劑盒檢測不同時長OGD/R后PC12細胞活力

圖2 CCK-8試劑盒檢測不同時長OGD/R后PC12細胞活力

2.3 不同時長OGD/R后PC12細胞炎癥因子的表達

與Normal組相比，OGD/R組細胞IRAK1和TNF-a在mRNA水平的表達升高，從OGD 6 h組開始IRAK1和TNF-a在mRNA水平的表達具有差異(P<0.05)，在OGD 12 h組達到高峰，在OGD 24 h組出現回落，見表3、圖3。

表3 QRT-PCR檢測不同時長OGD/R后PC12細胞IRAK1和TNF-a在mRNA水平的表達

圖3 QRT-PCR檢測不同時長OGD/R后PC12細胞IRAK1和TNF-a在mRNA水平的表達

3 討論

IS是最多見的中樞神經系統腦血管病之一，然而，影響IS病理生理和康復的決定因素還知之甚少，先前的研究已經確定了幾種與IS有關的機制，其中，誘導缺血后炎癥的先天免疫反應在IS進展中起著關鍵作用[5]。作為先天免疫的重要參與環節，促炎細胞因子IRAK1和TNF-a被認為在卒中的病理生理過程中扮演著尤為重要的角色[6，7]。髓系分化因子88招募IRAK4進而磷酸化IRAK1，最終導致下游的核因子-κB的激活和TNF-a的釋放[8，9]。這些發現強調了IRAK1和TNF-a是調節免疫反應的重要靶點。在體外PC12細胞OGD/R模型中，OGD的時間是關鍵，OGD時間過長可能誘導過度的炎癥反應導致細胞死亡，OGD時間過短則可能無法有效地誘導炎癥反應。因此，對于OGD/R后PC12細胞炎癥反應的相關研究很有必要，其中OGD的時間窗是關鍵的研究要點，也是后續研究PC12細胞炎癥反應機制及IS后神經元保護的基礎。

在本研究中，我們通過構建體外PC12細胞OGD/R模型以觀察PC12細胞不同時間OGD/R后細胞形態學及炎癥因子表達的變化，探討神經元OGD不同時間后對炎癥反應的影響。結果顯示，倒置顯微鏡下觀察未進行OGD/R處理的PC12細胞生長良好形態正常，進行OGD/R處理的細胞，隨著OGD時間的延長，細胞損傷逐漸加重，主要表現為細胞樹突和軸突回縮，細胞固縮死亡。相關研究報道，在缺血性腦損傷中，缺血后小鼠腦內蛋白的破壞程度及其對缺血結局的影響隨其缺血時間的延長而增加[10，11]，與本研究結果一致。本研究中，OGD 3 h細胞損傷沒有明顯變化，可能原因是OGD 3 h對PC12細胞是一個短暫的亞致死性階段，因而再灌注不會導致太大的損傷。OGD 12 h后細胞損傷嚴重甚至大量死亡，說明合適的OGD時間至關重要。與Normal組相比OGD各組細胞活性隨著時間的延長逐漸降低。相關研究報道，在OGD致PC12細胞損傷的體外模型中OGD導致細胞存活率顯著下降[12]，與本研究結果一致。我們進一步研究發現OGD組細胞中IRAK1和TNF-a的表達量明顯增加，表明不同時長OGD/R后均可誘導PC12細胞的炎癥反應，在OGD 6 h組開始有顯著性差異，在OGD 12 h組達到高峰。相關研究報道，在體外建立PC12細胞OGD/R模型中缺氧缺血性腦病組炎癥因子IRAK1和TNF-α表達均高于對照組，與本研究結果一致[12]。隨著OGD時間的進一步延長導致大量自由基的產生進而氧化細胞膜磷脂中的不飽和脂肪酸，導致膜損傷，隨后通過壞死或凋亡模式導致細胞大量死亡，故炎癥因子的分泌反而減少，在OGD 24 h組出現回落。

綜上所述，OGD 6 h后再復糖復氧能較好地在體外誘導PC12細胞炎癥反應且對細胞損傷較小，故推薦在體外OGD模型研究中OGD的時長采用6 h為宜。這對于后續神經炎癥相關干預措施的選擇研究及對缺血性卒中神經元保護的研究具有重要指導價值。