三種抗雙鏈DNA抗體檢測方法在系統性紅斑狼瘡診斷中的效能評價

畢 勝，朱紅艷，余亞玲，沈燕迪，李文潤

(云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院 1.檢驗科 2.腎內科，云南 昆明 650032)

抗雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)抗體是系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)標志性抗體，美國風濕病學會已將其列為SLE的診斷標準之一，同時抗dsDNA抗體滴度與疾病的活動及腎臟受累相關，臨床用于監測病情活動和療效。因此，抗dsDNA抗體的檢測是否準確可靠對于臨床醫生診療SLE非常重要。臨床檢測抗dsDNA抗體比較常用的有間接免疫熒光法(indirect immunofluorescent assay，IIFA)、免疫印跡法(immunoassay，LIA)、酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和化學發光法(chemiluminescent immunoassay，CLIA)等，本研究比較IIFA，LIA和ELISA三種方法的分析性能，評價最佳檢測方法，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集2017年9月-2018年4月在云南省第一人民醫院就診并確診為SLE的患者血清93份，其中，男性患者8例，女性患者85例，年齡8～69歲，平均年齡29.5歲。同時收集同時段其他自身免疫性疾病患者的血清標本84份(類風濕性關節炎55例，皮肌炎10例，混合結締組織病5例，強直性脊柱炎5例，干燥綜合征4例，血管炎3例，系統性硬化癥2例)作為疾病對照組，其中男性患者26例，女性患者58例，年齡18～78歲，平均年齡48.3歲。收集排除患自身免疫性疾病的健康體檢者的血清標本50份作為正常對照組，其中男15例，女35例，年齡23～48歲，平均年齡32.6歲。入組患者的疾病診斷標準均符合國內或國際相關疾病的診療標準或指南。

1.2 試劑與儀器

抗dsDNA抗體IgG檢測試劑盒(間接免疫熒光法)，抗核抗體譜(IgG)檢測試劑盒(免疫印跡法)，抗dsDNA抗體IgG檢測試劑盒(酶聯免疫吸附法)，3種試劑均購同一公司。設備主要是Leica熒光顯微鏡DM3000，全自動免疫印跡儀EUROBlot Master44，酶標測試儀KHB ST-360。

1.3 方法

3種方法均嚴格按照試劑盒說明書操作，結果判定：IIFA法用Leica熒光顯微鏡在40×下觀察基質片中綠蠅短膜蟲的動基體發出熒光為陽性；LIA法是在抗dsDNA抗原的膜條位置出現顯色反應則為陽性；ELISA法為定量檢測法，分別以3份標準品的濃度和吸光度為橫、縱坐標作標準曲線，并根據標準曲線求出患者樣本中抗dsDNA抗體的濃度，濃度≥100IU/mL為陽性。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 抗dsDNA抗體的檢測結果

在SLE患者組中，抗dsDNA抗體檢測陽性率最高的是ELISA法(60.2%)，其次為LIA法(46.2%)，最低的為IIFA法(38.7%)，均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P=0.012)，見表1。

表1 3種方法檢測抗dsDNA抗體陽性率比較[n(%)]

2.2 3種方法的性能分析比較

以臨床診斷為標準，計算3種抗dsDNA抗體檢測方法的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值及陰性預測值，見表2。ELISA法敏感度和陰性預測值最高(60.2%，77.7%)，IIFA法特異性和陽性預測值最高(99.3%，97.3%)

表2 3種方法檢測抗dsDNA抗體的評價指標(%)

2.3 診斷價值

采用ROC曲線分析IIFA、LIA和ELISA 3種方法檢測抗dsDNA抗體在診斷SLE中的價值，見圖1。曲線下面積(area under the curve，AUC)ELISA是0.782，LIA是0.724，IIFA是0.690，說明ELISA法檢測抗dsDNA抗體診斷價值最高。

圖1 3種檢測方法ROC曲線

2.4 3種檢測方法的一致性分析

IIFA方法和LIA方法診斷結果一致性較好(Kappa=0.881，P<0.001)；IIFA診斷陽性率為16.3%，明顯低于LIA診斷(19.8%)，且差別具有統計學意義(P=0.008)。IIFA方法和ELISA方法診斷結果一致性一般(Kappa=0.693，P<0.001)；IIFA診斷陽性率明顯低于ELISA診斷(26.9%)，且差別具有統計學意義(P<0.001)。LIA方法和ELISA方法診斷結果一致性較好(Kappa=0.804，P<0.001)；LIA診斷陽性率明顯低于ELISA診斷(26.9%)，且差別具有統計學意義(P<0.001)。

3 討 論

抗DNA抗體的靶抗原為DNA雙螺旋結構，反應位點位于DNA的脫氧磷酸框架上，抗DNA抗體分為抗dsDNA抗體和抗ssDNA(single-stranded DNA，ssDNA)抗體。抗dsDNA抗體主要見于SLE患者，也偶爾見于其他自身免疫性疾病、感染性疾病，極少數情況見于健康人。抗dsDNA抗體是反應SLE疾病活動較理想的一個指標[1，2]。根據抗dsDNA抗體檢測的方法及疾病的進展階段不同，抗體的陽性率達到20～90%[3]，本研究中SLE組IIFA、LIA和ELISA法檢出陽性率分別是38.7%、46.2%和60.2%。

目前臨床上檢測抗dsDNA抗體的方法眾多，主要包括IIFA，ELISA、LIA和Farr法，但各有優缺點。IIFA法以綠蠅短膜蟲為基質，蟲體內的動基體由純的環狀dsDNA構成，不含有其他抗原，因此具有高度的特異性，該方法被認為是檢測抗dsDNA抗體的金標準[3]，本實驗中顯示該方法發現特異度與陽性預測值最高的是IIFA法(99.3%、97.3%)，但是敏感度最低(38.7%)。靈敏度與陰性預測值最高的是ELISA法(60.2%、77.7%)，與相關報道一致[5，6]。ELISA法將dsDNA包被在聚乙烯板上時，dsDNA容易變性為單鏈DNA，從而影響抗dsDNA抗體的檢測的特異度性，且有報道稱某些其他因素如類風濕因子可引起該方法檢測抗dsDNA抗體假陽性[7]，但是ELISA能進行定量、半定量測定，該方法在使用過程中應該建立適合本地區的參考區間[8]。LIA法所用膜條上轉印著dsDNA抗原的同時也轉印著其他多種自身抗原，在檢測抗dsDNA抗體的同時只需少量血清即可檢測其他多種自身抗體，比如抗線粒體抗體M2型(AMA-M2)[9]。本研究ROC曲線下面積顯示3種方法中ELISA診斷價值是最高的，其次是LIA、IIFA。

本文對IIFA與LIA法、IIFA與ELISA法、LIA與ELISA法檢出陽性率進行比較，結果顯示差異有統計學意義(P<0.05)；一致性分析顯示IIFA與LIA法、LIA與ELISA法一致性較好，而IIFA與ELISA法一致性一般。抗dsDNA抗體可分為低親和力和高親和力抗體，而不同的檢測方法對這兩種親和力抗體檢測的敏感度不一樣，ELISA和LIA法對低、高親和力dsDNA抗體都能檢測出來，且易受單鏈DNA的干擾，但是IIFA法對低親和力抗體敏感度低。有文獻報道稱dsDNA-IIF和高親合力抗dsDNA 抗體-ELISA聯合診斷SLE敏感率為 90.5%，特異性為 100%[10]。有文獻報道LIA與ELISA法一致性較差略有不同[6]。這可能與ELISA法不同廠家的試劑盒有關，而本實驗LIA和ELISA法用的是同一廠家的試劑盒，因此一致性較好。因此，建議臨床上采用兩種方法聯合檢測dsDNA抗體，這樣有助于避免誤診或者漏診[11]。

綜合考慮，ELISA法檢測抗dsDNA抗體敏感性高，可進行半定量，但IIFA法特異度最高，因此建議臨床上同時應用ELISA法和IIFA法檢測抗dsDNA抗體，對SLE診斷和病情活動監測有重要意義。