天祝白牦牛IFN-γ、IL-2和MHC抗病基因多態(tài)性研究

吳貝寧，魯媛媛，高 原，張雅欣，王進娥，霍生東

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

白牦牛是世界上罕見的牦牛地方類群和遺傳資源，被列為國家級家畜品種，并享有“高原白珍珠”之稱。牦牛具有耐寒、耐粗、耐勞、耐缺氧等特點，可以利用其他家畜無法利用的高寒草場牧草資源，為農(nóng)牧民提供肉、乳、毛皮、役力等生產(chǎn)資料和生活資料[1]。有研究報道，動物對多種疾病的抵抗力在一定程度上取決于基因。因此，通過發(fā)現(xiàn)抗病基因來進行抗病育種，可以提高動物的免疫力，降低藥物用量，從而推動畜牧業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

干擾素（interferon,IFN）主要來源于T淋巴細胞，是一種具有抗病毒、抗腫瘤、提高免疫力的蛋白質(zhì)因子。干擾素家族[2]是出現(xiàn)最早且作用最快的一種抗病毒體系。根據(jù)IFN的結(jié)構(gòu)及抗原性，可以將其分為IFN-a、IFN-β、IFN-γ三大類；按照受體類型，可以分為I型IFN和Ⅱ型IFN，I型IFN包含IFN-a、β等[3]，Ⅱ型IFN只有IFN-γ一種類型，又稱為免疫干擾素，且與機體免疫功能調(diào)節(jié)相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，除了以上兩種之外，根據(jù)IFN與其受體的結(jié)合方式，又可分為三種類型，即IFN-A1、IFN-A2、IFN-A3。

目前已有研究表明，IFN基因?qū)δ[瘤細胞的生長及抗病毒感染都有一定作用。Guzman等[5]通過對牛IFN基因和抗病毒作用的研究發(fā)現(xiàn)，牛BoIFN-γ對水泡性口炎病毒有明顯的抑制作用，且具有3個抗病毒活性區(qū)段。說明該基因可能與牛對病毒的抗性有關(guān)聯(lián)，并且此基因與牛的抗病毒能力存在一定關(guān)系。

白細胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）是趨化因子家族的一種細胞因子，它能促進活化的T細胞生長和分化，增強T細胞的殺傷活性、分化及增殖能力[6]。已有研究表明，IL-2直接或間接的具有生長因子和分化信號[7]，其作用機制可能與Tc細胞的增殖有關(guān)[8]。但目前關(guān)于IL-2基因多態(tài)性的相關(guān)研究較少。

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）是超基因家族中的一個大類[9]。牛的MHC又被稱為BoLA基因[10]。MHC是影響免疫反應(yīng)和識別的重要因素，它與動物的易感性和抗性有關(guān)，是一種具有重要意義的抗性遺傳基因。另外，已有研究顯示，MHC基因多態(tài)性與許多疾病的耐受性及敏感性相關(guān)，如口蹄疫[5]、乳腺炎[11]等。

本試驗以天祝白牦牛為研究對象，通過對與動物抗病力密切相關(guān)的IFN-γ、IL-2和MHC基因的多態(tài)性進行研究，為研究天祝白牦?？共C制提供理論基礎(chǔ)，為牦牛健康養(yǎng)殖和綠色養(yǎng)殖提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗對天祝藏族自治縣13只健康白牦牛（2～5歲）進行頸靜脈采血，每只3 ml，所采集的樣品具有品種的典型特征。采集的牦牛血使用EDTAK2進行抗凝，再低溫送回實驗室于-20 ℃保存，備用。

1.2 血液DNA的提取

按照購買的DNA試劑盒說明書，提取牦牛的基因組DNA，將得到的基因組DNA分成兩份，一份-20 ℃保存，另一份用來PCR擴增，然后使用UV1800紫外分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗血液DNA的濃度和純度。

1.3 引物設(shè)計及目的片段擴增

根據(jù)NCBI上已公布牛MHC（Gene ID：282530）、牛IFN-γ（Gene ID：102267095）和牛IL-2（Gene ID：102272426）基因DNA的參考序列，利用在線軟件Primer-Blast設(shè)計引物，引物信息見表1，對基因部分的外顯子和內(nèi)含子設(shè)計序列。引物由北京奧科鼎盛生物科技公司合成。

表1 基因引物序列

PCR反應(yīng)體系（25 μl）：2×F8 Master Mix 12.5 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μl，基因組DNA 4 μl，滅菌超純水7.5 μl。經(jīng)過多次摸索最終確定反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性10 s，65.4 ℃/63.5 ℃/66 ℃退火30 s，72 ℃延長1 min，4 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳法對擴增產(chǎn)物進行檢測。

1.4 PCR-SSCP檢測

取6 μl變性上樣Buffer置于PCR管內(nèi)，加入PCR反應(yīng)產(chǎn)物，振蕩混勻，98 ℃水浴10 min變性后，迅速取出冰浴8 min。將PCR產(chǎn)物與變性buffer混合液上樣至加樣孔，然后在聚丙烯酰胺凝膠中160 V電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠取出進行染色。主要過程：先用蒸餾水清洗2遍，將凝膠放在染色盤并倒入染色液，放置在水平搖床上搖晃15 min，確保染色均勻，染色后用雙蒸水洗膠，倒入顯色液，溶液變黑，倒出，再用雙蒸水清洗，再次倒入適量的顯色液在搖床上搖晃30 min，待DNA條帶合適，用雙蒸水終止顯色，并拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取結(jié)果

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的DNA，結(jié)果如圖1所示。所提取的DNA條帶清晰，說明血液DNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)試驗。

圖1 牦牛血液DNA提取結(jié)果

2.2 牦?；驍U增結(jié)果

根據(jù)表1所列引物信息，對反應(yīng)條件進行多次優(yōu)化，最終確定最優(yōu)條件，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測牦牛IFN-γ、IL-2、MHC基因的PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果如圖2～4所示，各基因擴增片段大小均與預(yù)期相符，且條帶清晰，特異性良好，可用于后續(xù)SSCP檢測。

圖2 IFN-γ基因擴增結(jié)果

圖4 MHC基因擴增結(jié)果

2.3 SSCP檢測結(jié)果

2.3.1IFN-γ基因檢測結(jié)果 對擴增IFN-γ基因進行SSCP檢測，結(jié)果顯示所擴增的IFN-γ基因出現(xiàn)一種帶型（圖5），命名為AA。

圖5 IFN-γ基因擴增片段SSCP檢測結(jié)果

2.3.2IL-2基因檢測結(jié)果 對擴增IL-2基因進行SSCP檢測，結(jié)果顯示所擴增的IL-2基因無多態(tài)性表現(xiàn)（圖6），命名為BB。

圖6 IL-2基因擴增片段SSCP檢測結(jié)果

2.3.3MHC基因檢測結(jié)果 對擴增MHC基因進行SSCP檢測，結(jié)果顯示所擴增的MHC基因出現(xiàn)兩種帶型（圖7），分別命名為TT和TA型。

圖7 MHC基因擴增片段SSCP檢測結(jié)果

3 討論

本試驗所用區(qū)段IFN-γ表現(xiàn)出一種帶型，在以往試驗中已經(jīng)證明[12]，IFN-γ可以協(xié)同間充質(zhì)干細胞發(fā)揮免疫抑制作用，而間充質(zhì)細胞可以有效促進造血干細胞移植，提高成功率，減少移植物抗宿主病。根據(jù)此試驗結(jié)果，可以試著將IFN-γ用于協(xié)同免疫抑制，從而提高臨床治療效果。Shaoyong Li等[13]研究表明，IFN-α負載的SLN可能是獸醫(yī)治療中有用的配方。Xiju Shi等[14]對MDBK/VSV細胞株進行了抗病毒活性測試，結(jié)果表明，6種重組的IFN-α（rIFN-α）對MDBK/VSV細胞株的抑制作用均比CEF/VSV強1 000倍以上。另外，rIFN-αs可以通過利用CPE抑制MDBK細胞株中感染性牛鼻氣管炎病毒的復(fù)制和增殖。結(jié)果表明，rIFN-αs是一種具有廣闊應(yīng)用前景的新型抗病毒藥物，它具有很好的生物活性和廣譜效應(yīng)。

本試驗未檢測出IL-2基因具有多態(tài)性，這可能是由于基因具有保守性或樣本量較小影響多態(tài)性的檢出。付滿良等[15]研究成功克隆了牦牛IL-2基因，其原核表達產(chǎn)物對牦牛具有顯著的免疫活性，為研制新型免疫增強劑提高牦牛的抗病能力和增強牦牛疫苗的免疫保護率奠定了良好基礎(chǔ)。同時白細胞介素IL-2能夠抑制腫瘤細胞的生長[16]。

MHC在本試驗中表現(xiàn)出高度多態(tài)性。Othman[17]研究結(jié)果顯示，不同的MHC基因型可能對提高埃及水牛特別是埃及流行的O型口蹄疫病毒有很大幫助。乳房炎是奶牛生產(chǎn)中最普遍的一種疾病，是造成奶牛業(yè)經(jīng)濟損失的重要原因之一[18]。DRB3基因是動物免疫系統(tǒng)中一個重要的多態(tài)性基因，多態(tài)性最為豐富的基因位點可在動物的免疫系統(tǒng)中高度表達，與許多疾病的耐受性、易感關(guān)系密切。由此推斷，MHC基因的多態(tài)性與隱性乳房炎有一定關(guān)系，這對奶牛隱性乳房炎的預(yù)防和治療具有一定的參考價值。

4 結(jié)論

本試驗對IFN-γ、IL-2和MHC基因的多態(tài)性與牦?？共≈g的關(guān)系進行了研究，結(jié)果顯示：IFN-γ只有一種基因型，IL-2未檢測出基因型，MHC具有兩種基因型。因此，天祝白牦牛抗病性主要與MHC基因的表達密切相關(guān)。