肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者miR-183-5p水平與經頸靜脈肝內門腔靜脈分流術后再出血的關系*

趙永昌，徐菁，陳士新，崔濤濤

（1.西安交通大學醫學院附屬三二〇一醫院1.影像科介入室，2.消化內科，陜西 漢中 723000；3.延安大學附屬醫院CT診斷科，陜西 延安 716099）

食管胃底靜脈曲張破裂出血是肝硬化門靜脈高壓的常見并發癥之一，治療后其再出血率仍高達30%～40%[1]。經頸靜脈肝內門腔靜脈分流術（transjugular intrahepatic portosystemic shunt,TIPS）是一種微創技術，其在預防再出血方面的優勢高于藥物聯合胃鏡下食管靜脈曲張套扎術治療，但仍有部分患者術后發生再出血[2-3]。因此，探究肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后再出血的風險因素有著重要意義。

目前，已有研究證實多數 microRNAs（miRNAs）參與了門靜脈高壓的發病和進展，如miR-26b[4]、miR-124 和miR-506 等[5]。microRNA-183-5p （miR-183-5p） 作為miRNAs 家族中一員，被證實可通過抑制血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1,HO-1）的表達降低炎癥和氧化應激損傷[6]。HO-1 可靶向氧化應激調節實驗性肝硬化伴門靜脈高壓大鼠的脾臟血流動力學及門靜脈壓[7]。基于上述研究，有理由認為miR-183-5p 通過調控HO-1 表達參與門靜脈高壓的形成，檢測miR-183-5p 水平或可用于預判食管胃底靜脈曲張破裂出血。目前，鮮有研究分析miR-183-5p 與食管胃底靜脈曲張破裂出血的關系。本研究擬分析肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者血清miR-183-5p 水平與TIPS 后再出血的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2017年2月—2020年10月在西安交通大學醫學院附屬三二〇一醫院接受TIPS 治療的178 例食管胃底靜脈曲張破裂出血患者作為研究對象。其中男性99 例，女性79 例；年齡35～79 歲，平均（57.71±8.95）歲；慢性乙型肝炎103 例，慢性丙型肝炎26 例，非酒精性脂肪性肝炎21 例，酒精性肝炎28例；Child-Pugh分級B級92例，C級86 例；平均血小板計數（113.88±28.95）×109/L，平均凝血酶原時間（15.47±3.28）s，平均國際標準化比率（1.35±0.31），平均血鈉（136.38±7.05）mmol/L，平均血鈣（2.10±0.48）mmol/L，平均白蛋白（31.02±5.14）g/L，平均門靜脈內徑（1.37±0.09）cm；輕、中度食管靜脈曲張160 例，重度食管靜脈曲張18 例。納入標準：①臨床診斷為肝硬化，門靜脈高壓誘發食管胃底靜脈曲張破裂出血；②經食管靜脈曲張組織膠注入術或胃鏡下食管靜脈曲張套扎術治療后仍反復出血；③患者或其家屬簽署知情同意書。排除標準：①非門靜脈高壓誘發的食管胃底靜脈曲張破裂出血；②伴門靜脈高壓性胃腸病、先天性膽道阻塞性疾病、嚴重感染、腹膜炎、肝性腦病或惡性腫瘤等；③嚴重心肝腎功能異常；④嚴重凝血功能異常或對碘制劑過敏；⑤伴膽管明顯擴張或多發囊腫等TIPS 禁忌證。本研究經醫院醫學倫理委員會批準[No：院倫理審（2017）002 號]。

1.2 方法

收集患者的臨床資料。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測miR-183-5p 水平[8]。抽取受試者TIPS 前（T1）、TIPS 后24 h（T2）和TIPS7 d（T3）的肘部靜脈血10 mL，離心后提取血清；用TRIzol 試劑盒提取血清中RNA，然后用紫外分光光度計檢測RNA 純度（OD260/OD280 在1.9～2.0）；用逆轉錄試劑盒[伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]將RNA逆轉錄為cDNA；用2720 型PCR 擴增儀（美國應用生物系統公司）擴增cDNA，反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃擴增30 s，共40 個循環。將U6作為內參。miR-183-5p 正向引物：5'-GCGGCTATGGCACTGGT AGAA-3'，反向引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGTAT TC-3'，長度90 bp；U6正向引物：5'-GCTTCGGCA GCACATATACTAAAAT-3'，反向引物：5'-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3'，長度94 bp。用2-ΔΔCt法計算血清miR-1180-3p 相對表達量，實驗3 次取平均值。

1.3 隨訪

患者出院后1 周采用復診和電話隨訪了解肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后是否再出血，每月隨訪1 次，末次隨訪時間為2021年10月23日。末次隨訪結束前發生再出血或因再出血死亡定義為終點事件。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或重復測量設計的方差分析；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制ROC 曲線；影響因素的分析用一般多因素Logistic 回歸模型；用一致性指數（concordance index,C-index）、校準曲線和決策曲線分析法（decision curve analysis,DCA）評價模型價值。P＜0.05 為差異有統計學意義

2 結果

2.1 患者TIPS后再出血情況

根據隨訪過程中是否再出血將患者分為再出血組和未再出血組。再出血組患者有55 例，其中18 例因再出血死亡。未再出血患者有123 例。見圖1。

圖1 兩組患者胃鏡圖像

2.2 兩組患者臨床資料比較

兩組患者性別、年齡、肝硬化病因、Child-Pugh 分級、血小板計數、凝血酶原時間和國際標準化比率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組患者白蛋白、血鈉、血鈣、門靜脈內徑和食管靜脈曲張程度比較，差異有統計學意義（P＜0.05），再出血組的白蛋白、血鈉和血鈣水平均低于未再出血組，門靜脈內徑大于未再出血組，重度食管靜脈曲張占比高于未再出血組。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

2.3 兩組患者不同時間點miR-183-5p 相對表達量比較

再出血組患者T1、T2和T3的miR-183-5p 相對表達量分別為（1.07±0.11）、（1.29±0.19）、（1.65±0.28），未再出血組患者分別為（1.25±0.16）、（1.33±0.12）、（1.65±0.20），經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點miR-183-5p 有差異（F=289.700，P=0.000）；②兩組患者miR-183-5p 有差異（F=22.999，P=0.000）；③兩組患者miR-183-5p 變化趨勢有差異（F=9.768，P=0.000）。

2.4 miR-183-5p對TIPS后再出血的診斷效能

T1時miR-183-5p 的曲線下面積（area under curve,AUC）和敏感性最高，分別為0.827（95% CI：0.768，0.886）和74.55%（95% CI：61.00，85.30），T3時miR-183-5p 的特異性最高，為88.62%（95% CI：81.60，93.60）。見表2和圖2。

圖2 miR-183-5p預測TIPS后再出血的ROC曲線

表2 miR-183-5p對TIPS后再出血的診斷效能分析參數

2.5 一般多因素Logistic回歸分析

以肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者的白蛋白、血鈉、血鈣、門靜脈內徑和T1-miR-183-5p 水平的中位數為界，將上述變量轉變為二分類變量。將肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后是否發生再出血（未發生=0，發生=1）作為因變量，將白蛋白（≤31.05 g/L=0，＞31.05 g/L=1）、血鈉（≤136.62 mmol/L=0，＞136.62 mmol/L=1）、血鈣（≤2.07 mmol/L=0，＞2.07 mmol/L=1）、門靜脈內徑（≤1.30 cm=0，＞1.30 cm=1）、食管靜脈曲張程度和T1時miR-183-5p（≤1.19=0，＞1.19=1）作為自變量，納入一般多因素Logistic 回歸分析，結果顯示：血鈉＞136.62 mmoL/L [=0.177（95% CI：0.073，0.429）]、血鈣＞2.07 mmoL/L [=0.386（95% CI：0.160，0.928）]和T1時miR-183-5p＞1.19[=0.079（95%CI：0.029，0.216）]是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血的保護因素（P＜0.05），門靜脈內徑＞1.30 cm [=3.094（95% CI：1.290，7.421）]和重度食管靜脈曲張[=8.342（95% CI：2.086，33.367）]是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血的危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS后再出血的Logistic回歸分析結果

2.6 模型構建及評價

用Logistic 回歸分析構建由血鈉、血鈣、門靜脈內徑和食管靜脈曲張程度組成的模型A，方程F=-0.482-1.770×血鈉-0.428×血鈣+0.796×門靜脈內徑+2.057×食管靜脈曲張程度；用Logistic 回歸分析構建由血鈉、血鈣、門靜脈內徑、食管靜脈曲張程度和T1時miR-183-5p 組成的模型B，方程F=0.536-1.748×血鈉-0.978×血鈣+1.140×門靜脈內徑+2.124×食管靜脈曲張程度-2.575×T1時miR-183-5p。模型A 的C-index 為0.771，模型B 為0.867。模型A 的平均絕對誤差值為0.025，模型B為0.028。模型B 預測肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血的凈收益高于模型A，校準曲線分別見圖3A、3B，DCA 曲線見圖3C。

圖3 模型A和模型B的校準曲線及DCA曲線

3 討論

TIPS 是食管胃底靜脈曲張破裂出血的二線治療方案，且療效顯著[9]。肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者接受TIPS 治療后發生再出血的主要原因是分流道失效，除此之外，在支架通暢的情況下亦可發生再出血[10]。本研究主要分析miR-183-5p 與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后再出血的關系。

本研究結果顯示再出血組T1時miR-183-5p 水平低于未再出血組，兩組的miR-183-5p 水平均隨時間進展呈升高趨勢，再出血組miR-183-5p 水平升高程度高于未再出血組，上述結果提示miR-183-5p 水平與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后再出血有關，或可用于再出血的預判。構建miR-183-5p 預測肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后是否發生再出血的ROC 曲線，結果顯示T1時miR-183-5p 預測肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后再出血的AUC 為0.827，大 于T2時miR-183-5p 和T3時miR-183-5p，該結果表明T1時miR-183-5p 預測肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后再出血的價值較高。

既往研究結果顯示肝硬化Child-Pugh C 級、血鈉、門靜脈內徑和食管靜脈曲張程度與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者再出血密切相關[11-14]。本研究進一步探究肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后再出血的風險因素，結果顯示血鈉＞136.62 mmoL/L 是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血的保護因素，門靜脈內徑＞1.30 cm 和重度食管靜脈曲張是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血的危險因素，與上述研究結果一致。本研究結果顯示肝硬化Child-Pugh C 級并非肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后再出血的危險因素，血鈣＞2.07 mmoL/L 是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血的保護因素，與上述研究結果存異，推測該差異與納入研究的樣本量大小有關，還需加大研究的樣本量進一步分析。

此外，本研究結果還顯示T1時miR-183-5p＞1.19 是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS后發生再出血的保護因素，推測其原因可能為：①支架內狹窄或閉塞會導致門靜脈壓升高，進而迫使食管胃底靜脈曲張破裂出血，是誘發TIPS 后再出血的主要原因之一[15]，炎癥和氧化應激與支架內狹窄、閉塞密切相關[16]，miR-183-5p 通過靶向HO-1 調節炎癥和氧化應激，進而參與了支架內狹窄過程，誘發TIPS 后再出血；②miR-183-5p 直接通過調控HO-1 表達，參與門靜脈高壓的形成，進而誘發TIPS 后再出血。

構建基于miR-183-5p 的模型B，其C-index 為0.867，高于模型A（0.771），該結果提示模型B 預測肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血的區分度高。模型B 的平均絕對誤差值為0.028，高于模型A（0.025），該結果提示兩模型預測肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血的精準度均較高，但模型A 略優于模型B。此外，模型B 預測肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血的凈收益高于模型A，該結果提示模型B 預測肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血的臨床價值較大。筆者認為模型B 可應用于預判肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后是否發生再出血。

但由于樣本量有限，本研究僅構建了預測肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后是否發生再出血訓練集，未增加驗證集，針對該不足，今后將擴大樣本量，增設驗證集。此外，增設基礎實驗，分析miR-183-5p 參與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后再出血的病理、生理機制。

綜上所述，肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 前miR-183-5p 水平高提示發生再出血的風險低。基于miR-183-5p 構建的模型B 對于預測肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者TIPS 后發生再出血有一定價值。