大蒜心腐病菌室內防治藥劑篩選

趙永強.楊峰.陸信娟.劉燦玉.張碧薇.楊青青.葛潔.史新敏.樊繼德

（江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所，江蘇 徐州 221121）

大蒜（L.）是一種重要的調味類蔬菜，同時也是一種具有保健功能的特殊食品，深受我國消費者歡迎。目前，我國大蒜產區主要集中在山東省、江蘇省和河南省，種植面積逐漸擴大。近年來隨著大蒜種植收益的提高，我國大蒜主產區連種年限逐漸延長，各種病蟲害發生日益嚴重，特別是大蒜心腐病的為害逐年加重，嚴重影響大蒜產量和品質。

大蒜心腐病是一種由細菌侵染引起的病害，2002年首先在江蘇鹽城、太倉的大蒜田發現，并由胡白石等人將其病原細菌鑒定并暫命名為熒光假單胞菌蔥屬致病變種（pv.Hu et Xu）。大蒜受到該病菌侵染后表現為生理性失調，植株生長受挫、畸形，葉片自葉尖向里變紅褐色。病菌首先感染莖盤基部，產生褐色病斑，病斑逐漸向上擴展到葉片組織，導致莖盤和假莖由內而外腐爛，并散發出魚腥味惡臭。

目前，大蒜心腐病僅在我國報道發生，受關注較少，且尚未有關于該病害防控技術方面的研究報道。為了促進對大蒜心腐病防控技術的研究，本團隊選擇了抗生素類、噻二唑類和有機銅類等三類殺菌劑中對細菌性病害有防治效果的藥劑14種，進行大蒜心腐病菌室內防治藥劑篩選，以期為大蒜心腐病菌的有效防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試大蒜心腐病菌菌株由本實驗室分離并保存，該菌株分離于江蘇省邳州市宿羊山鎮大蒜心腐病典型癥狀植株，采集日期為2019年3月27日，菌株經過3次單菌落純化、致病性驗證和16S序列比對。

1.2 供試藥劑

選取了三類市售的細菌性殺菌劑共計14種，包括（1）抗生素類殺菌劑：0.3%四霉素水劑（遼寧微科生物工程有限公司）、3%中生菌素可濕性粉劑（深圳諾普信農化股份有限公司）、2%春雷霉素水劑（日本北興化學工業株式會社）、8%寧南霉素水劑（德強生物股份有限公司）、72%農用鏈霉素可濕性粉劑（成都普惠生物工程有限公司）；（2）噻二唑類殺菌劑：30%噻唑鋅懸浮劑（浙江新農化工股份有限公司）、60%葉枯唑粉劑（北美農大集團）；（3）有機銅類殺菌劑：30%壬菌銅微乳劑（西安近代科技實業有限公司）、15%絡氨銅水劑（天津博克百勝科技有限公司）、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑（齊齊哈爾四友化工有限公司）、23%松脂酸銅乳油（山東禾宜生物科技有限公司）、20%噻菌銅懸浮劑（浙江龍灣化工有限公司）、33.5%喹啉銅懸浮劑［興農藥業（中國）有限公司］、20%噻森銅懸浮劑（浙江東風化工有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試菌株準備

于試驗前1 d將大蒜心腐病菌接種到LB液體培養基，置于恒溫搖床28℃活化12 h左右。用無菌水調配菌液濃度為1×10CFU/mL。

1.3.2 藥劑配制

根據預試驗結果，用LB液體培養基配制各參試藥劑高濃度母液（按照各藥劑活性成分計算）：8%寧南霉素水劑、23%松脂酸銅乳油、72%農用鏈霉素可濕性粉劑、20%噻森銅懸浮劑、33.5%喹啉銅懸浮劑、20%噻菌銅懸浮劑51200 mg/L，0.3%四霉素水劑、3%中生菌素可濕性粉劑、2%春雷霉素水劑、30%噻唑鋅懸浮劑、60%葉枯唑粉劑、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑、30%壬菌銅微乳劑、15%絡氨銅水劑1600 mg/L。

1.3.3 參試藥劑對大蒜心腐病菌最低有效抑菌濃度（MIC）測定

參試藥劑MIC的測定采用含毒介質法：將500 μL大蒜心腐病菌懸液加入到20 mL LB液體培養基中，搖勻。取滅菌細胞培養板，每個孔內加入上述LB液體培養基200 μL。將200 μL高濃度藥劑母液加入細胞培養板A排孔內，混勻，按比例吸取混合后的藥液加入B排孔，依次操作到G排孔為止。將H排孔設置為空白對照，加入等量無菌LB液體培養基，混勻。棄掉各孔內多余混合液，使各個孔內的混合液體積保留200 μL，各藥劑設3次重復。將細胞培養板置于培養箱內28℃恒溫培養，待空白對照混合液出現渾濁，將各孔混合液再次混勻后，吸取20 μL加入到新的滅菌培養板對應孔內，孔內預先加入180 μL無菌LB液體培養基，重新置于培養箱中培養，待空白對照混合液再次出現渾濁，觀察比較結果。

1.3.4 活性藥劑對大蒜心腐病菌抑菌效果測定

根據MIC值測定結果，選取對大蒜心腐病菌有抑菌活性的藥劑，采用抑菌圈法測定其抑菌效果。選取藥劑的參試濃度設置為：0.3%四霉素水劑200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L；3%中生菌素可濕性粉劑600 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L；2% 春 雷 霉 素水劑800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、100 mg/L；30% 噻唑鋅懸浮劑、15%絡氨銅水劑、60%葉枯唑粉劑、30%壬菌銅微乳劑、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑2400 mg/L、2000 mg/L、1600 mg/L、1200 mg/L、800 mg/L；23%松脂酸銅乳油16000 mg/L、12800 mg/L、9600 mg/L、6400 mg/L、3200 mg/L；8%寧南霉素水劑22400 mg/L、19200 mg/L、16000 mg/L、12800 mg/L、9600 mg/L。藥劑用無菌水稀釋。

1.3.5 盆栽驗證四霉素水劑對大蒜心腐病的防治效果

選擇四霉素水劑進行盆栽防治試驗，用量參照花生拌種推薦濃度160 mL·100 kg種子。選擇大蒜品種“徐蒜6號”為參試品種，挑選大小較為一致的蒜瓣，清水浸泡約15 h，取出瀝干水分，四霉素藥劑拌種，清水作為對照，處理后蒜瓣種植于花盆中，每盆均勻播種20個，每處理各栽種6盆。蒜瓣覆土前，各澆施菌懸液1 mL。花盆置于人工氣候室26℃、12 h/12 h光暗交替培養，分別于栽種后12 d和36 d按植株病情分級記錄心腐病發生情況，計算病情指數及防治效果。

大蒜植株心腐病發病情況調查時，橫向切去大蒜植株莖盤底部1～2 mm，按照莖盤基部剖面病斑面積占剖面總面積的百分比將病情分為5級。

0級：莖盤剖面無病斑；

1級：莖盤剖面病斑面積＜25%；

3級：25%≤莖盤剖面病斑面積＜50%；

5級：50%≤莖盤剖面病斑面積＜75%；

7級：莖盤剖面病斑面積≥75%。

病情指數計算公式為：

1.4 數據處理

數據的整理與分析采用軟件 Microsoft Office Excel 2007 完成 。

2 結果與分析

2.1 參試藥劑對大蒜心腐病菌最低有效抑菌濃度（MIC）

參試藥劑對大蒜心腐病菌MIC測定結果如表1所示，供試的14種藥劑中0.3%四霉素水劑、3%中生菌素可濕性粉劑、2%春雷霉素水劑、30%噻唑鋅懸浮劑、30%壬菌銅微乳劑、15%絡氨銅水劑、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑、60%葉枯唑粉劑、23%松脂酸銅乳油、8%寧南霉素水劑等10種藥劑在參試濃度范圍內對大蒜心腐病菌有抑制效果。其中，抑菌活性最高的是0.3%四霉素水劑、3%中生菌素可濕性粉劑和2%春雷霉素水劑，MIC分別為0.20 mg/L、50.00 mg/L和100.00 mg/L。20%噻菌銅懸浮劑、72%農用鏈霉素可濕性粉劑、33.5%喹啉銅懸浮劑、20%噻森銅懸浮劑等4種藥劑在有效成分濃度25600.00 mg/L時仍無抑菌效果。

表1 參試藥劑對大蒜心腐病菌MIC測定結果

2.2 活性藥劑對大蒜心腐病菌的抑菌效果

上述10種活性藥劑對大蒜心腐病菌的抑菌效果測定表明，在參試濃度范圍內僅0.3%四霉素水劑產生抑菌圈，且經3次重復驗證均得到相同的結果。0.3%四霉素水劑200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L處理產生的抑菌圈直徑平均為2.26 cm、1.93 cm、1.35 cm、0.82 cm、0.44 cm。 以藥劑濃度的對數為自變量，抑菌圈的平均直徑為因變量，求出毒力回歸方程為=0.6853-1.3208，=0.9926。

2.3 四霉素對大蒜心腐病的盆栽防治效果

四霉素水劑拌種對大蒜心腐病的防治效果如表2所示，四霉素水劑按照160 mL·100 kg大蒜種子的用量拌種，可以有效降低大蒜心腐病的發生，處理后12 d防治效果可達65.59%，但是隨著時間的延長，其防治效果逐漸降低，處理后36 d的防治效果降為43.41%，降幅為33.82%。

表2 四霉素水劑拌種對大蒜心腐病的防治效果

3 討論與結論

山東省、河南省和江蘇省是我國大蒜三大優勢產區，近年來三大主產區大蒜苗期“死苗”現象越來越嚴重，嚴重地塊死苗率可達30%、感染率達到80%以上，給大蒜生產造成嚴重損失。根據本團隊多年實地調查與研究發現，大蒜“死苗”現象主要是由細菌性病害大蒜心腐病和蟲害蒜蛆、刺足根螨單獨或共同為害引起。

本研究根據細菌性病害防治藥劑類型特征，從抗生素類、噻二唑類和有機銅類等三類殺菌劑中選擇對細菌性病害有防治效果的藥劑14種，依次通過測定最低有效抑菌濃度、抑菌效果、盆栽防治效果等室內藥劑篩選方法，確定四霉素水劑對大蒜心腐病菌具有較高的抑菌活性，并且盆栽條件下對大蒜心腐病也有較好的防治效果，可用于大蒜心腐病的防治。

雖然本研究結果表明，除四霉素水劑外其余13種藥劑對大蒜心腐病菌的抑制效果較差，但是由于各藥劑的作用機理不同，如噻菌銅懸乳劑等有機銅類殺菌劑并非直接作用于病原菌，在抑菌方面表現較差，但可能在大田有較好的防治效果。因此，需要通過更廣泛的盆栽或田間試驗，以進一步篩選大蒜心腐病適用藥劑，從而可以輪換或復配使用，以達到提高防治效果和延緩抗藥性產生的目的。